E3连接酶TRIM8通过k48关联的多泛素化作用靶向MYOF降解抑制肺癌转移

　　

E3 连接酶 TRIM8 抑制肺癌转移机制研究：开启肺癌治疗新方向

来自国立中兴大学（National Chung Hsing University）生物医学科学研究所的研究人员，在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “E3 ligase TRIM8 suppresses lung cancer metastasis by targeting MYOF degradation through K48-linked polyubiquitination” 的论文。这一研究成果在肺癌研究领域意义重大，为深入了解肺癌的发病机制以及开发新的治疗策略提供了关键线索。

研究背景：迷雾中探寻肺癌治疗新希望

肺癌，这个全球范围内的 “健康杀手”，一直是导致恶性肿瘤相关死亡的主要原因之一，在台湾地区也不例外。根据组织学特征，非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）作为肺癌的主要类型，又可细分为肺腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。尽管在治疗策略上，手术、放疗、化疗和靶向治疗等不断取得进展，但由于肺癌早期诊断困难，很多患者确诊时已经出现广泛转移，导致预后极差，五年生存率较低，这让肺癌的治疗成为医学领域亟待攻克的难题。

肿瘤的发生、发展和转移是一个极其复杂的过程，受到多种因素的调控。其中，肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）在肺癌的生长和转移中起着重要的调节作用。肿瘤微环境中包含具有促肿瘤或抑肿瘤功能的先天和适应性免疫细胞，巨噬细胞就是其中的重要成员。巨噬细胞被招募到肿瘤微环境后，会分化为肿瘤相关巨噬细胞，成为肿瘤微环境中占主导地位的免疫细胞类型。M1 巨噬细胞能够诱导促炎反应，保护机体免受损伤，被视为抗肿瘤巨噬细胞；而 M2 巨噬细胞则参与血管生成、伤口愈合和组织重塑，具有免疫抑制作用，会促进肿瘤的进展。此前的研究发现，M1 巨噬细胞共培养能够降低 A549 肺癌细胞的活力和增殖能力，M2 巨噬细胞共培养则会促进其生长和侵袭。

泛素化（Ubiquitination）作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，通过泛素 - 蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System）对肿瘤进展相关蛋白进行调控，这使得 E3 泛素连接酶成为潜在的抗肿瘤靶点。TRIM8 作为 TRIM 家族的成员以及一种 E3 连接酶，在多种疾病和肿瘤发生过程中发挥作用，但其在肺癌中的真正角色一直存在争议，尚未明确。部分研究表明，TRIM8 可通过 p53 肿瘤抑制蛋白发挥肿瘤抑制作用，也有研究提出相反观点，认为它作为癌基因能够促进 NF - κB 通路的激活。因此，深入探究 TRIM8 在肺癌中的作用机制迫在眉睫。

研究方法：多管齐下，解锁关键机制

在本次研究中，研究人员运用了多种先进技术，从细胞水平到动物模型，再到临床样本分析，全方位深入探究 TRIM8 在肺癌中的作用机制。

在细胞实验方面，研究人员选取了人非小细胞肺癌细胞系 A549、H358 和 CL1 - 0 进行研究。通过细胞转染技术，利用 TRIM8 特异性 shRNA 沉默 TRIM8 的表达，同时构建稳定过表达 TRIM8 的细胞系，以此来观察 TRIM8 表达变化对肺癌细胞功能的影响。运用细胞增殖实验（如 PrestoBlue?试剂检测法）、迁移实验（Transwell 实验和划痕伤口愈合实验）、侵袭实验（Matrigel 侵袭实验）、共免疫沉淀实验、蛋白质免疫印迹（Western blotting）和流式细胞术分析等多种实验方法，全面评估细胞的各项生物学功能变化。

为了在体内验证 TRIM8 的作用，研究人员建立了小鼠异种移植模型。将 mock 对照、oeTRIM8、shLacZ 和 shTRIM8 的肺癌细胞（CL1 - 0 和 H358 为个细胞；A549 为个细胞）皮下注射到无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）的 ASID 小鼠右后胁，观察肿瘤的发生和转移情况。对小鼠组织样本进行苏木精 - 伊红（Hematoxylin and Eosin，H&E）染色，在显微镜下观察肿瘤的形态和结构变化。

为了深入了解 TRIM8 调控肺癌细胞的分子机制，研究人员进行了 RNA 测序分析。提取细胞 RNA 后，使用 SimpliNano? - Biochrom 分光光度计进行定量，利用 KAPA mRNA HyperPrep Kit 试剂盒构建测序文库，在 Illumina NovaSeq 6000 平台上进行测序，生成 150bp 的双端测序读长。对测序数据进行过滤、比对、定量和差异表达基因分析，并运用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析和聚类分析等方法，挖掘 TRIM8 调控的关键基因和信号通路。

在数据分析方面，研究人员将实验数据以平均值 ± 标准差（SD）的形式呈现，在进行统计分析前，先对数据分布、组内变异和组间方差进行分析评估，根据评估结果选择合适的统计分析方法，如单因素方差分析（ANOVA）、两样本 t 检验、配对 t 检验等。通过这些严谨的分析方法，准确判断实验结果的统计学意义，确保研究结论的可靠性。

研究结果：层层揭开 TRIM8 的神秘面纱

TRIM8 被 M1 亚型巨噬细胞上调

研究人员基于之前对 A549 细胞经极化巨噬细胞条件培养基（Conditioned Medium，CM）处理后的基因表达谱研究，筛选出受 M1 和 M2 巨噬细胞调控的差异表达基因。通过对 A549 细胞与 M1、M2 巨噬细胞 CM 共培养 48 小时后的基因数据进行分析，筛选出 M1 上调且 M2 下调的潜在抑癌基因，以及 M1 下调且 M2 上调的潜在癌基因。在这些基因中，TRIM8 引起了研究人员的关注，RT - qPCR 结果显示，M1 巨噬细胞能够显著诱导 TRIM8 mRNA 的表达。进一步通过 Western blotting 实验发现，与 M1 巨噬细胞共培养后，A549 细胞中 TRIM8 的表达上调；而使用 TRIM8 特异性 siRNA 沉默 TRIM8 表达后，其表达水平明显降低。功能实验表明，沉默 TRIM8 会促进 A549 细胞的增殖和迁移，而 M1 巨噬细胞共培养则抑制细胞的增殖和迁移，这表明 TRIM8 可能具有抑癌作用。

TRIM8 表达与 NSCLC 患者的临床结局相关

研究人员利用基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）分析肺癌患者中 TRIM8 mRNA 的表达情况，发现肺癌组织中 TRIM8 mRNA 的水平明显低于正常组织。对台湾地区的肺癌队列进行分析，也得到了相似的结果，并且在配对的肿瘤 - 正常组织样本中，肿瘤组织中 TRIM8 的表达显著降低。通过对台湾地区 68 例肺腺癌患者以及公开数据库中其他肺癌患者队列进行生存分析发现，TRIM8 低表达的患者总体生存期明显短于高表达患者。单因素 Cox 比例风险回归分析表明，除了 I 期肺鳞状细胞癌患者外，TRIM8 在非小细胞肺癌患者的临床结局中具有保护作用，这进一步提示 TRIM8 在肺癌发展过程中可能发挥着肿瘤抑制作用。

TRIM8 表达抑制 NSCLC 细胞增殖和克隆形成

为了进一步验证 TRIM8 在肺癌细胞中的功能，研究人员在 A549（p53 野生型）、CL1 - 0（p53 248W 突变型）和 H358（p53 缺失型）肺癌细胞系中进行实验。通过构建稳定过表达 TRIM8 的细胞克隆，发现 TRIM8 过表达能够显著抑制这些肺癌细胞的增殖。相反，使用 shRNA 沉默 TRIM8 表达后，细胞增殖受到的抑制作用得到缓解。体外锚定依赖性实验结果显示，TRIM8 转染细胞的集落形成能力相较于 mock 对照组降低了 50% 以上，而 shTRIM8 转染细胞的集落形成能力则比 shLacZ 转染细胞显著增加 1.5 - 4 倍，这表明 TRIM8 能够有效抑制肺癌细胞的增殖和克隆形成能力。

TRIM8 抑制肺癌细胞迁移和侵袭

Transwell 实验结果显示，TRIM8 过表达的肺癌细胞在三种不同细胞系中的垂直迁移能力均明显低于 mock 转染细胞；而 TRIM8 敲低则能有效逆转这种抑制作用。划痕伤口愈合实验表明，在 CL1 - 0 和 H358 细胞中，TRIM8 过表达细胞的水平迁移能力显著低于 mock 转染细胞，敲低 TRIM8 后，细胞的水平迁移能力得到恢复。由于侵袭是癌症转移的起始步骤，研究人员通过 Matrigel 侵袭实验评估 TRIM8 对细胞侵袭的影响，发现 TRIM8 过表达能够显著抑制所有三种细胞系的细胞侵袭能力，而沉默 TRIM8 表达则会使细胞侵袭能力明显增强，这说明 TRIM8 对肺癌细胞的迁移和侵袭具有显著的抑制作用。

TRIM8 减弱 NSCLC 在体内的肿瘤发生和转移

在皮下异种移植模型实验中，研究人员将 TRIM8 过表达细胞（oeTRIM8#mix 克隆）和对照细胞植入 ASID 小鼠体内。结果发现，与 mock 对照组相比，TRIM8 转染组的肿瘤重量明显降低，虽然不同细胞系的皮下肿瘤生长情况存在差异，但 TRIM8 转染能够显著抑制所有三种细胞系的皮下肿瘤细胞向肝脏的转移，肝脏中形成的肿瘤结节数量明显减少。相反，敲低 TRIM8 则会促进肿瘤发生，并略微促进 CL1 - 0 肿瘤细胞向肝脏的扩散。显微镜观察进一步证实，mock 对照组中 CL1 - 0 和 H358 肺癌细胞系的总肿瘤面积明显大于 TRIM8 转染组，这表明 TRIM8 在体内能够有效抑制肿瘤的形成和转移。

通过 RNA 测序分析鉴定 TRIM8 的下游靶基因

为了明确 TRIM8 调节 NSCLC 增殖和迁移的分子机制，研究人员对 mock 对照和混合 TRIM8 过表达的 A549、CL1 - 0 和 H358 细胞进行 RNA 测序分析。结果发现，与对照组相比，A549、CL1 - 0 和 H358 细胞中分别有 2918、92 和 353 个转录本的表达差异达到两倍以上。通过对三种细胞系中差异表达转录本的重叠分析，得到 15 个候选转录本，其中包括 TRIM8。在这 15 个转录本中，有 8 个在三种细胞系中受 TRIM8 调控的趋势一致，排除长链非编码 RNA（lncRNAs）CH507 - 513H4 和 LUCAT1 后，对剩下的 5 个转录本进行验证。RT - qPCR 结果显示，TRIM8 过表达会降低 MYOF（Myoferlin）mRNA 的水平，敲低 TRIM8 则会在 CL1 - 0 和 H358 细胞中逆转这种变化。此前研究表明 MYOF 与多种癌症的转移和侵袭性密切相关，对 H358 细胞进行 MYOF 沉默实验发现，MYOF 敲低会抑制细胞的增殖和迁移，与 TRIM8 过表达的作用相似，这表明 MYOF 可能是 TRIM8 的关键下游靶基因。

MYOF 表达挽救了 TRIM8 介导的肿瘤迁移抑制

为了进一步验证 MYOF 在 TRIM8 介导的肺癌细胞生长和迁移抑制中的作用，研究人员将 pCDNA3.1 - MYOF - HA 质粒共转染到 TRIM8 过表达的 CL1 - 0 和 H358 细胞中。Western blot 实验证实 MYOF 成功过表达，并且发现 TRIM8 能够显著抑制 MYOF 的蛋白水平。集落形成实验结果显示，MYOF 对细胞增殖的影响在 CL1 - 0 和 H358 细胞中存在差异，但 Transwell 实验表明，MYOF 过表达能够增加两种细胞的迁移能力，挽救了 TRIM8 过表达对细胞运动能力的抑制作用。同时，恢复 MYOF 表达还能挽救 TRIM8 抑制的肺癌细胞侵袭能力。此外，敲低 TRIM8 会增加 MYOF 的蛋白水平，在 shTRIM8 转染细胞中沉默 MYOF 能够消除 TRIM8 缺失导致的细胞增殖和迁移增加，这进一步证明了 TRIM8 通过抑制 MYOF 的表达来抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。

TRIM8 催化 MYOF 泛素化

由于 TRIM8 是一种 E3 连接酶，研究人员推测 MYOF 可能通过蛋白酶体依赖的途径被降解。实验结果显示，蛋白酶体抑制剂 MG132 能够显著增加被 TRIM8 抑制的 MYOF 蛋白水平，这表明 MYOF 的降解依赖于蛋白酶体。共免疫沉淀实验证实了 TRIM8 和 MYOF 蛋白之间存在相互作用，并且在 TRIM8 转染细胞中，MYOF 上标记的泛素量更高。通过转染不同类型的泛素（野生型、K48 型、K63 型和 K0 型）进行实验发现，在 TRIM8 泛素化 MYOF 的过程中，K48 连接的泛素化是主要机制，这揭示了 TRIM8 调节 MYOF 的分子机制。

研究结论与讨论：照亮肺癌治疗的新征程

综合以上研究结果，研究人员发现 TRIM8 在肺癌的发生、发展过程中起着重要的肿瘤抑制作用。它能够抑制肺癌细胞的增殖、集落形成、迁移、侵袭和转移，肺癌组织中 TRIM8 的表达低于正常组织，并且与患者的生存情况呈负相关。TRIM8 通过促进 MYOF 在细胞质中通过 K48 连接的泛素化降解，抑制肺癌细胞的运动能力，至少部分是通过 TRIM8 - MYOF - MMP 轴实现的。这一发现为肺癌的治疗提供了新的潜在治疗策略和生物标志物。例如，可以通过筛选能够上调 TRIM8 表达的化合物，或者开发蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis Targeting Chimaeras，PROTACs）来增强 TRIM8 对 MYOF 蛋白的靶向作用，为肺癌患者带来新的希望。

然而，该研究也存在一些有待进一步探索的问题。虽然研究揭示了 TRIM8 在肺癌中的重要作用机制，但 TRIM8 作为肿瘤抑制因子在细胞核中的精确作用，以及它对 MYOF mRNA 的调控机制仍未完全阐明。此外，在肺癌进展过程中，TRIM8 与肿瘤微环境之间的调控相互作用也尚不明确，例如 M1 巨噬细胞诱导 TRIM8 表达的具体机制还需要深入研究。同时，为了将 TRIM8 作为可靠的预后生物标志物应用于临床，还需要更大规模的临床队列进行验证。

尽管如此，这项研究仍然为肺癌研究领域做出了重要贡献。它不仅揭示了 TRIM8 在肺癌发生发展中的关键作用，还为后续研究指明了方向。相信在未来，随着对 TRIM8 研究的不断深入，有望开发出更加有效的肺癌治疗方法，为众多肺癌患者带来福音，让我们在攻克肺癌这一难题的道路上迈出更加坚实的一步。