PHGDH抑制和FOXO3调节驱动puma依赖性骨肉瘤细胞凋亡

　　

联合抑制疗法为骨肉瘤治疗带来新曙光

近日，来自华盛顿大学圣路易斯分校（Washington University in St. Louis）的研究人员在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “PHGDH inhibition and FOXO3 modulation drives PUMAdependent apoptosis in osteosarcoma” 的论文。这一研究成果在骨肉瘤治疗领域意义非凡，为攻克这一难治性疾病带来了全新的思路和潜在治疗方案。

研究概述：直击骨肉瘤治疗难题

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是一种常见的原发性恶性骨肿瘤，在儿童和成人中均有发病，且极易转移至肺部。目前，骨肉瘤的标准化疗方案是使用阿霉素、顺铂和大剂量甲氨蝶呤（HD - MTX），然而该方案已沿用 40 多年，不仅疗效提升有限，还伴随着严重的毒性反应，如 HD - MTX 会抑制二氢叶酸还原酶（DHFR），虽能抑制肿瘤细胞的 DNA 复制并诱导细胞死亡，但所需剂量的药物毒性极大，可引发黏膜炎、骨髓抑制、肝毒性和肾毒性等，尤其对成人患者影响更为严重。因此，寻找更有效且低毒的治疗方法迫在眉睫。

研究发现，骨肉瘤在代谢上高度依赖由葡萄糖经限速酶 3 - 磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）转化为丝氨酸的过程。PHGDH 的上调与患者生存率低下密切相关，抑制 PHGDH 虽能抑制骨肉瘤细胞增殖，但由于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1（mTORC1）通路的激活，无法有效诱导细胞死亡。基于此，本研究旨在探究联合抑制 PHGDH 和调节 mTORC1 信号通路在骨肉瘤治疗中的作用机制及疗效，为开发新的治疗策略提供理论依据。

研究方法：多技术协同解锁治疗新机制

1. 细胞实验：研究人员选用多种细胞系，包括人骨肉瘤细胞系 NOS1、U2OS，人乳腺癌细胞系 MDA - MB231、MDA - MB468、MCF7 等，以及患者来源的异种移植（PDX）模型。通过慢病毒介导的 CRISPR/Cas9 技术构建基因敲除细胞系，如 PHGDH 敲除、FOXO1 敲除、FOXO3 敲除和 FOXO1/3 双敲除的 U2OS 细胞系等，用于探究基因功能。

2. 药物处理：使用 PHGDH 抑制剂 NCT - 503、mTORC1 抑制剂（如非雷帕霉素类抑制剂 perhexiline、ALPI3MT55）、泛半胱天冬酶抑制剂 Z - VAD - FMK、GSK3 抑制剂 BIO、20S 蛋白酶体抑制剂 Bortezomib、Src 家族激酶抑制剂 saracatinib 和 PP2 等处理细胞，观察细胞的增殖、死亡及相关信号通路变化。

3. 检测技术：运用自动化细胞成像和定量分析系统（Incucyte S3）对细胞数量、细胞死亡、细胞周期进行监测；采用 NanoString 代谢基因面板分析和基因集富集分析（GSEA）筛选差异表达基因和相关信号通路；利用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术检测蛋白质表达和磷酸化水平；通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）检测 mRNA 表达水平；使用质谱和比色分析法测定细胞内 AMP/ATP 比值。

4. 动物实验：构建骨肉瘤异种移植小鼠模型和 PDX 小鼠模型，将 U2OS 细胞或 PDX 肿瘤组织接种到小鼠体内，待肿瘤达到一定体积后，对小鼠进行分组给药，包括单独使用 NCT - 503、ALPI3MT55、perhexiline，以及它们的联合用药，观察肿瘤生长情况和小鼠体重变化，评估药物疗效。

研究结果：联合疗法展现强大抗癌潜力

1. PHGDH 抑制对骨肉瘤细胞的影响：研究人员发现，与 PHGDH 低表达的 MDA - MB231 细胞相比，骨肉瘤细胞系和 PDX 模型中 PHGDH 均呈高表达。使用 NCT - 503 抑制 PHGDH 后，骨肉瘤细胞增殖受到抑制，但未诱导细胞死亡。通过 NanoString 代谢基因面板分析和 GSEA 发现，NCT - 503 和 perhexiline 处理均影响 mTOR 和 FOXO 信号通路，且 perhexiline 处理显著上调 AMPK 通路相关基因表达。进一步研究表明，非雷帕霉素类 mTORC1 抑制剂 perhexiline 和 ALPI3MT55 与 NCT - 503 联合使用时，能显著抑制 mTORC1 活性，诱导细胞死亡，而雷帕霉素与 NCT - 503 联合使用则无此效果。

2. 联合治疗诱导骨肉瘤细胞凋亡：通过检测裂解的半胱天冬酶 3（cleaved Caspase 3）水平，研究人员发现，单独使用 NCT - 503 或 perhexiline 处理骨肉瘤细胞时，Caspase 3 裂解水平未增加；而联合使用 NCT - 503 和 perhexiline 后，Caspase 3 裂解显著增加。ALPI3MT55 单独处理时可使 Caspase 3 裂解略有增加，与 NCT - 503 联合使用时增加更为显著。此外，使用泛半胱天冬酶抑制剂 Z - VAD - FMK 可抑制这种细胞死亡，表明联合治疗诱导的细胞死亡类型为凋亡。

3. 联合治疗对凋亡相关基因的调控：研究发现，NCT - 503、perhexiline 或 ALPI3MT55 处理均可上调促凋亡基因 PUMA、NOXA 和 BIM 的转录水平，联合处理时上调更为明显，其中 PUMA 在所有处理条件下表达均显著增加。进一步研究表明，PUMA 基因敲除后，联合治疗诱导的 Caspase 3 裂解和细胞死亡显著减少，说明 PUMA 在联合治疗诱导的凋亡中起关键作用。同时，联合治疗可降低抗凋亡蛋白 MCL1 的表达，且不影响其 mRNA 水平，表明 mTORC1 抑制剂可在翻译水平调控 MCL1 表达，促进细胞凋亡。

4. NCT - 503 对 AMP/ATP 比值和 AMPK 激活的影响：NCT - 503 处理骨肉瘤细胞后，细胞内 AMP/ATP 比值升高，且通过质谱和比色分析法证实了这一结果。PHGDH 基因敲除实验表明，NCT - 503 诱导的 AMP/ATP 比值升高是通过抑制 PHGDH 实现的，且该比值升高可激活 AMPK。此外，perhexiline 可通过抑制 FYN 蛋白，间接激活 AMPK，增强 NCT - 503 诱导的细胞死亡。

5. FOXO3 在联合治疗中的关键作用：研究发现，NCT - 503 和 perhexiline 处理可激活 FOXO 通路，增加 FOXO3 蛋白丝氨酸 413 位点的磷酸化水平；ALPI3MT55 处理则可降低 FOXO1/3 蛋白苏氨酸 24/32 位点的抑制性磷酸化水平，促进 FOXO1/3 核转位。通过构建 FOXO1 敲除、FOXO3 敲除和 FOXO1/3 双敲除细胞系发现，在联合治疗诱导的细胞死亡中，FOXO3 起主导作用，其激活可诱导 PUMA 表达，促进细胞凋亡。

6. 联合治疗对 c - MYC 表达的调控：激活的 FOXO3 可通过诱导 GSK3 依赖性蛋白酶体降解，抑制 c - MYC 蛋白表达，且不影响其转录水平。联合治疗可显著抑制 c - MYC 蛋白表达，促进其降解，使用 GSK3 抑制剂 BIO 和蛋白酶体抑制剂 Bortezomib 可恢复 c - MYC 蛋白表达。此外，联合治疗还可抑制 c - MYC 靶基因（如细胞周期相关基因 CDK1、CCNA2、CCNB1 和线粒体基因 PPARGC1B、PPRC1、TFAM、TOMM20）的转录和表达，抑制骨肉瘤细胞增殖。

7. 联合治疗在体内的疗效：在骨肉瘤异种移植小鼠模型和 PDX 小鼠模型中，研究人员发现，单独使用 NCT - 503、ALPI3MT55 或 perhexiline 均无法有效抑制肿瘤生长；而 NCT - 503 与 ALPI3MT55 联合使用可显著抑制肿瘤生长，且不影响小鼠体重。三药联合（NCT - 503、perhexiline 和 ALPI3MT55）治疗时，抑制肿瘤生长的效果最为显著，且在多种癌症细胞系（包括低 PHGDH 表达的 MDA - MB231、MCF7 和高 PHGDH 表达的 MDA - MB468，以及小细胞肺癌、滑膜肉瘤、尤因肉瘤细胞系）中均能有效诱导细胞死亡，但对正常的原代成骨细胞无明显影响。

研究结论与讨论：开启骨肉瘤治疗新篇章

本研究首次揭示了联合抑制 PHGDH 和调节 mTORC1 信号通路在骨肉瘤治疗中的协同作用机制。研究表明，PHGDH 抑制联合非雷帕霉素类 mTORC1 抑制剂（如 perhexiline、ALPI3MT55）可通过激活 FOXO3，诱导 PUMA 表达，促进骨肉瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。这一联合治疗策略不仅在体外细胞实验中展现出强大的抗癌效果，在体内动物模型中也得到了验证，为骨肉瘤的治疗提供了新的潜在方案。

此外，研究还发现了 FYN 蛋白在调节 AMPK 和 AKT 信号通路中的关键作用，以及联合治疗对 c - MYC 表达的调控机制，进一步丰富了对骨肉瘤发病机制和治疗靶点的认识。虽然目前 PHGDH 抑制剂尚未进入 I 期临床试验，开发三药联合疗法仍面临挑战，但 ALPI3MT55 和 perhexiline 联合治疗已展现出潜在的临床应用价值，有望开展 I 期临床试验，为替代 HD - MTX 的毒性治疗提供可能。

总体而言，该研究成果为骨肉瘤的治疗开辟了新方向，为后续临床研究和药物开发奠定了坚实基础，有望为骨肉瘤患者带来新的希望。