开发用于有丝分裂后神经元中膜锚定 LC3A/B 的选择性去结合酶：开启神经自噬研究新征程

为探究膜锚定 LC3A/B 在神经元自噬中的作用，研究人员开发选择性去结合酶，其对 LC3A/B 有高特异性，为相关疾病研究奠基。

　　在神秘的细胞世界里，神经元就像一群不知疲倦的卫士，守护着我们的神经系统。然而，随着时间的推移和各种因素的影响，神经元内部会堆积许多 “垃圾”，比如错误折叠的蛋白质、受损的细胞器等。这些 “垃圾” 如果不及时清理，就会像堆积如山的杂物一样，让神经元 “不堪重负”，最终导致功能障碍，引发像阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病。

自噬（Autophagy）这个过程，就像是神经元的 “清洁小助手”，负责降解这些受损的细胞成分，维持神经元的健康。在自噬过程中，有一对关键的蛋白 —— 微管相关蛋白 1A/1B 轻链 3（LC3）和 γ- 氨基丁酸受体相关蛋白（GABARAP），它们发挥着重要作用。LC3 存在脂质化（LC3-II）和非脂质化（LC3-I）两种形式，GABARAP 也有类似的两种状态。当自噬发生时，细胞质中的 LC3-I/GABARAP-I 会与磷脂酰乙醇胺（PE）结合，形成脂质化的 LC3-II/GABARAP-II，这一过程对于自噬体（autophagosome，一种包裹着待降解物质的双层膜结构）的形成和货物招募至关重要。而且，LC3/GABARAP 蛋白还参与调节膜动态变化、囊泡运输等过程，甚至在非经典途径如 LC3 相关吞噬作用中也有它们的身影。

尽管 LC3 和 GABARAP 家族蛋白如此重要，但之前一直缺乏能够选择性抑制脂质化 LC3/GABARAP-II 的技术，这就像在探索一座神秘城堡时，缺少了关键的钥匙，阻碍了科学家们对膜锚定 LC3/GABARAP 在有丝分裂后神经元中功能的研究。

为了解开这个谜团，韩国韩南大学（Hannam University）和庆北国立大学（Kyungpook National University）的研究人员 Haneul Choi、Sang-Won Park 等人展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Molecular Brain》杂志上。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是构建多种突变体，通过对去结合酶（deconjugases）进行改造，比如将 N 端的 LC3 相互作用区域（LIR）进行顺序排列，并删除 C 端 LIR，同时对催化结构域（CAD）的 α₃螺旋进行氨基酸突变；其次是细胞实验，在 HKO HeLa 细胞和小鼠皮层神经元中表达这些突变体，观察其对自噬体形成的影响；最后利用蛋白质免疫印迹（Western blot）和共聚焦显微镜（confocal microscopy）等技术检测相关蛋白的表达水平和自噬体的形成情况。

下面来看看具体的研究结果：

1. 突变体构建与分析：研究人员构建了 2xFy-CAD 突变体，它是通过顺序排列 N 端 LIRs 并删除 C 端 LIR 得到的。同时，为了研究 α₃螺旋在 LC3/GABARAP-II 去脂质化过程中的作用以及与 N 端 LIRs 的协同作用，他们对 α₃螺旋进行了突变，用丙氨酸替换特定氨基酸，得到多个突变体，如 YFKGKYR 突变为 AAAGAAA、YFAGAYA、AAKGKAR、AAAGKYR、YFKGAAA 等。
2. HKO HeLa 细胞实验结果：将这些 2xFy-CAD 变体在 HKO HeLa 细胞中表达，并评估其对过表达 LC3B 和 GABARAPL1 的自噬体形成的影响。有趣的是，2xFyCAD (AAAGKYR) 和 2xFy-CAD (YFKGAAA) 与 RavZ (C258S)（一种 RavZ 的催化失活突变体）类似，都不影响含 GABARAPL1 的自噬体形成。然而，2xFy-CAD (AAAGKYR) 无法抑制含 LC3B 的自噬体形成，说明其功能不足。
3. 神经元细胞实验结果：研究人员在小鼠皮层神经元中转染 2xFy-CAD (YFKGAAA)，并使用 Western blot 和共聚焦显微镜评估 LC3B 和 GABARAPL1 的切割以及自噬体的形成。用 50μM 氯喹（CQ）处理神经元，阻断自噬体 - 溶酶体融合，增加 LC3/GABARAP-II 水平，以便评估酶的特异性。结果显示，与去结合酶 - Fy 和 2xFy-CAD 相比，2xFyCAD (YFKGAAA) 能选择性地使内源性 LC3B 去脂质化。而且，在自噬诱导和抑制条件下（100mM 海藻糖处理 24 小时、10nM 巴弗洛霉素 A₁（BafA1）处理 24 小时），2xFy-CAD (YFKGAAA) 能特异性抑制小鼠皮层神经元中含 LC3B 的自噬体形成，同时不影响含 GABARAPL1 的自噬体形成。

研究结论表明，N 端 LIR 基序和 α₃螺旋在调节源自 RavZ 的去结合酶在自噬中的特异性和功能方面非常重要。通过顺序排列 N 端 LIRs 并突变 α₃螺旋降低疏水性，得到的 2xFy-CAD (YFKGAAA) 变体能够选择性地使 LC3B 去脂质化，而不影响含 GABARAP 的自噬体。这一特异性在神经元自噬中意义重大，因为 LC3A/B 介导的过程对于维持神经元的细胞内稳态和其他神经元功能至关重要。2xFy-CAD (YFKGAAA) 对 LC3A/B 具有较高的特异性，是分析 LC3A/B 介导通路的有力工具。

不过，这项研究也存在一些局限性。比如，2xFy-CAD (YFKGAAA) 与结构相似的蛋白质如 LC3C 和 GABARAPL2 的潜在相互作用尚未在本研究中测试。未来可以进一步探究这些相互作用，以完善该工具的特异性，扩大其在自噬相关研究中的应用范围。此外，将人类来源的模型，如患者特异性诱导多能干细胞（iPSCs）和脑类器官整合到研究中，能提供更符合生理相关背景的研究环境，有助于研究疾病特异性自噬机制，还能为高通量治疗筛选提供平台。

总的来说，这项研究开发的选择性去结合酶为研究膜锚定 LC3 蛋白的独特作用提供了新的视角，克服了以往研究方法对脂质化 LC3/GABARAP 形式缺乏选择性的局限。这不仅为研究自噬调节及其在神经退行性疾病中的意义开辟了新途径，还为开发以亚型特异性方式调节自噬的治疗策略提供了理论框架，在生命科学和医学领域具有重要的研究价值和应用前景。