综述：20年来对巨型病毒的研究

　　

巨型病毒 20 年研究综述

特蕾西?博斯蒙（Tressy Bosmon）、尚塔尔?阿贝热尔（Chantal Abergel）、让 - 米歇尔?克拉弗里（Jean-Michel Claverie）

大约二十年前，第一种巨型病毒 —— 多食棘阿米巴拟菌病毒（现称布拉德福德马赛拟菌病毒）的发现，为发现十多个新的感染原生生物的 DNA 病毒家族开辟了道路。这些病毒在病毒粒子的形状和大小、基因内容、基因组拓扑结构和复制方式等方面展现出意想不到的多样性。在对这些病毒进行简要描述之后，来自艾克斯 - 马赛大学（Aix–Marseille University）的研究人员探讨了病毒学的历史概念在这些新知识的光照下是如何发展的。尽管最初的关注点在于新发现的感染变形虫的巨型病毒，但随后发现的具有中等大小病毒粒子和基因组的病毒，逐渐在核质病毒门（Nucleocytoviricota）中最小和最大的病毒之间建立起了连续性。

传统上，迪米特里?伊万诺夫斯基（Dimitry Ivanovsky）和马丁?拜耶林克（Martin Beijerinck）被认为是病毒的发现者。1892 年，伊万诺夫斯基首次证明了存在一种通过尚贝兰滤烛过滤后仍未被去除的感染性因子；1898 年，拜耶林克提出这种导致烟草花叶病的因子与当时已知的微生物（细菌）性质完全不同，并创造了 “病毒（virus）” 这个术语。不幸的是，他将病毒错误地解释为 “传染性活液（contagium vivum fluidum）”（一种非颗粒性的感染性液体），这引发了关于病毒本质的争论和困惑，这种情况在病毒学早期一直存在，直到病毒粒子最终在第一台电子显微镜下被揭示出来。在病毒最初被发现 65 年多之后，安德烈?利沃夫（André Lwoff）提出了病毒的正式概念。

利沃夫具有里程碑意义的文章提出了一系列定性特征，用于区分病毒和非病毒，具体如下：
a. 病毒粒子（即颗粒）仅含有一种核酸，要么是 DNA，要么是 RNA。而其他生物（即细胞生物）则同时含有两种核酸。
b. 病毒粒子仅通过其核酸进行繁殖，而其他生物则是通过其所有组成部分的整合来繁殖。
c. 病毒粒子无法生长，也不能进行二分裂。
d. 病毒缺乏合成负责产生 ATP 的利普曼系统（Lipmann system）的遗传信息。
e. 病毒利用宿主细胞的核糖体，这被定义为绝对寄生。
f. 病毒缺乏合成核糖体蛋白、核糖体 RNA 和转移 RNA 的信息。

利沃夫的重要贡献在于强调病毒和非病毒之间不存在中间状态，这一观点在当时并非得到所有人的认同。这也是他那句颇具挑衅性的格言 “病毒就是病毒（viruses are viruses）” 的含义。这也是为什么他提出的标准都不是定量的，以避免出现阈值效应，因为这与他所主张的病毒世界和细胞世界之间的绝对界限不相符 —— 尽管这一严格界限的一些初始标准后来受到了一些质疑，但它至今仍未被完全推翻。

不幸的是，在 20 世纪病毒学的发展过程中，随着在人类、动物和植物疾病研究中分离出许多新病毒，研究人员偏离了这个严格定义的范式，重新引入了更符合实际操作的定量标准。例如，超过滤性（ultrafiltrability），即病毒粒子能够通过 “除菌” 过滤器（孔隙率 < 0.3μm）的特性，成为并一直是一个主要标准，尽管利沃夫并未将其纳入自己的标准之中，尽管它具有一定的历史意义。在大多数环境研究中，无论是用于病毒分离还是宏基因组分析，使用孔径逐渐减小的过滤器进行大小分级仍然是样品处理的第一步。认为病毒必然是最小微生物的错误观念，可能使巨型病毒的发现推迟了很多年。

在对包括噬菌体在内的许多病毒进行表征后，病毒学家发现这些病毒的基因含量比细胞微生物小得多。于是，他们开始将这一特征（认为是其 obligatory parasitism 的预期结果）视为整个病毒世界的基本特征。但艾克斯 - 马赛大学的研究人员发现，这其实是一种过早的概括。

由于大多数病毒编码的蛋白质数量较少，其中大部分是病毒粒子的结构成分（对于最复杂的病毒来说，基因组复制酶也很少），除了利沃夫标准中已经强调的缺乏能量代谢之外，缺乏任何生物合成能力也被认为是病毒的普遍特征。根据利沃夫的标准，任何与蛋白质合成相关的酶功能也被认为是病毒所不具备的。但这同样是一个过早的假设。

20 世纪对大量不同病毒的分离和研究，还让人们认为在宿主细胞质中复制的病毒和在细胞核中复制的病毒之间存在明显的界限。但对于一些新发现的病毒，这一界限如今已变得模糊。

最后，过去一个世纪的病毒学研究让人们认为病毒代表了微生物世界中寄生的最底层。但随着噬病毒体（virophages）和一些与病毒相关的可移动遗传元件的发现，这一观点已发生改变。

本文回顾了过去 20 年中发现的多个感染原生生物的 DNA 病毒新家族（表 1 和表 2）。它们不同寻常的特征促使人们对核质大 DNA 病毒（Nucleocytoplasmic Large DNA viruses，即 “NCLDV”）的分类进行了全面重新评估。这些病毒在新创建的核质病毒门（Nucleocytoviricota）中构成了新的进化枝，除了以前已确立的家族，如痘苗病毒科（Poxviridae）、虹彩病毒科（Iridoviridae）、非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）和藻 DNA 病毒科（Phycodnaviridae）。令人惊讶的是，尽管这些新发现开辟了病毒学的全新领域，但它们都没有显著违背利沃夫在 65 年前提出的主要区分标准。

拟菌病毒：巨型病毒时代的先驱

在 20 多年的时间里，最大病毒基因组的记录由草履虫小球藻病毒（Paramecium bursaria chlorella virus，即 PBCV - 1）保持，它是感染单细胞藻类小球藻的病毒属的原型，基因组大小为 331kb。2004 年，这一记录被多食棘阿米巴拟菌病毒打破。这种感染变形虫的病毒粒子足够大（直径 0.75μm），在光学显微镜下即可轻松观察到，其双链 DNA 基因组大小为 1.181Mb，具有独特的序列。经测定，这种首个 “巨型病毒” 编码 979 种蛋白质、33 种非编码 RNA 和 6 种 tRNA，其遗传复杂性可与一些细菌相媲美。它也是第一种拥有四种氨酰 - tRNA 合成酶（翻译过程的基本组成部分）和五种其他翻译因子（包括一种肽链释放因子）的病毒，这表明它可能起源于一种祖先寄生细胞的还原性进化。然而，拟菌病毒预测的蛋白质中，70% 对应着 ORFans，在细胞或病毒世界中没有同源物，这使得它的起源充满争议，至今仍备受讨论。

从 2009 年智利巨型病毒（megavirus chilensis）开始，在世界各地和各种环境中分离出了越来越多与拟菌病毒亲缘关系较远的病毒，这确立了最初的拟菌病毒科（Mimiviridae）的广泛分布和高度多样性。如今，拟菌病毒科已发展为拟菌病毒目（Imitervirales），包含另外 3 个不同的科（表 1 和表 2）。拟菌病毒最接近的亲属现在被归为巨拟菌病毒亚科（Megamimivirinae），其中最引人注目的成员是土潘病毒（tupanviruses），其基因组大小可达 1.516Mb，编码一整套氨酰 - tRNA 合成酶（表 1 和表 2）。土潘病毒粒子的结构也很独特，具有一个大型的二十面体衣壳，延伸出一条长尾，使整个病毒粒子长度可达 2μm（图 1B）。

巨拟菌病毒亚科的所有成员都具有高达 450nm 的二十面体衣壳，结构高度复杂，外部有一层长度不一的高度糖基化纤维，与一组不同的蛋白质相关联（图 1A）。病毒编码的糖基化机制合成其复杂的、具有进化枝特异性的聚糖（表 2）。内部的脂质膜包裹着由双果冻卷折叠的主要衣壳蛋白（MCP）、多达 5 种 MCP 旁系同源物和其他次要衣壳蛋白组成的衣壳外壳。内部的一个隔室 —— 类核，包含基因组和在宿主细胞质中启动早期基因转录所需的蛋白质。感染时，被宿主细胞液泡内化的病毒粒子通过打开一个顶点处的特定结构 ——“星门（stargate）”，释放其类核，从而使病毒粒子和液泡膜融合。这导致了一种类似细胞器的结构 —— 病毒工厂（VF）的形成，最近有研究提出它是由相分离形成的。在类核中，拟菌病毒的基因组被组织成一种长而灵活的螺旋结构（直径 30nm），由与 GMC 氧化还原酶意外同源的蛋白质包裹着基因组，转录机制位于基因组纤维的中心。

拟菌病毒科的所有成员（表 1）似乎都具有线性双链 DNA 基因组，两侧是长末端重复序列（TIR），巨拟菌病毒亚科的 TIR 长度可达 26kb（Claverie 等人，正在准备中）。在核质病毒门中，这种基因组拓扑结构与其他 3 个较远的病毒进化枝共享：痘苗病毒（Chitovirales 目）、非洲猪瘟病毒（Asfuvirales 目）和绿藻病毒（Algavirales 目）。由于所有这些以 TIR 结尾的基因组都已被证明具有共价交联（发夹）末端，因此推测拟菌病毒科也可能如此。在整个拟菌病毒目中，研究人员注意到异拟菌病毒科（Allomimiviridae）是一个有趣的例外，它是目前已知的唯一包含具有环状双链 DNA 基因组成员（四鞭藻病毒 1（Tetraselmis virus 1）和滴水湖大型藻类病毒 1）的科（表 1）。

对于拟菌病毒目的大多数成员来说，宿主细胞核在感染过程中似乎未受干扰，但克洛斯诺病毒亚科（Klosneuvirinae）的成员除外，它们会导致宿主中的细胞核降解，这些宿主包括变形虫 Vermamoeba vermiformis 和海洋动基体目生物 Bodo saltans。目前，对于克洛斯诺病毒亚科的所有成员，有人提出在较大的、被纤维覆盖的二十面体衣壳内还嵌套着一层额外的衣壳。

拟菌病毒科和中拟菌病毒科（Mesomimiviridae）成员的另一个惊人特征是，它们的病毒工厂可能成为较小病毒（称为 “噬病毒体（virophages）”）寄生感染的目标。噬病毒体具有约 20kb 的环状双链 DNA 基因组，病毒粒子大小约 50nm，现在被归类到它们自己的科 —— 拉维病毒科（Lavidaviridae）。它们在巨型病毒的病毒工厂中复制，使用与巨型病毒相同的调控元件（晚期启动子和发夹规则），并依赖其复制机制。它们既可以干扰巨型病毒的复制，也可以与之共生。感染 Rheavirus 属成员的噬病毒体 mavirus，其基因组可以整合到细胞宿主（Cafeteria 属成员）的基因组中。当相关的巨型病毒感染时，噬病毒体会被重新激活，从而保护细胞宿主群体。因此，噬病毒体可以作为一些原生生物的抗病毒防御机制。缺乏自身主要衣壳蛋白基因的噬病毒体仍可以作为附加体在病毒粒子中繁殖，或者整合到其巨型伴生病毒的基因组中。

对巨拟菌病毒亚科几个成员的测序，导致了一种新的可移动遗传元件 —— 转座病毒子（transpoviron）的发现。它们是长度为 7kb 的双链 DNA，以 TIR 结尾的线性分子，编码 6 - 8 种蛋白质。转座病毒子主要作为附加体在巨型病毒或噬病毒体粒子中繁殖，但也可以在噬病毒体或巨型病毒的基因组中发现它们的整合。

马赛病毒：处于病毒巨型化的边缘

在发现拟菌病毒之后，对其他感染棘阿米巴的病毒的研究意外地在 2009 年发现了与之无关的马赛病毒。它成为了马赛病毒科（Marseilleviridae）的原型，该科在核质病毒门的皮马斯科病毒目（Pimascovirales）中迅速发展。通过共培养或宏基因组分析，在世界各地的各种环境中都分离出了该科的成员。它们具有高达约 380kb 的环状基因组，病毒粒子具有直径约 250nm 的二十面体衣壳（图 1A）。它们都编码主要的依赖 DNA 的 RNA 聚合酶亚基（表 2），最初被认为是完全在细胞质中复制的病毒，直到对病毒粒子进行基于质谱的蛋白质组分析后发现，这些酶并未装载在病毒粒子中。在感染周期的早期阶段，马赛病毒会诱导宿主细胞核发生变化，招募核转录机制到其新生的病毒工厂，表达早期基因，包括那些编码病毒 RNA 聚合酶亚基的基因。之后，细胞核的完整性会恢复。因此，马赛病毒科可能是完全在细胞质中复制的巨型病毒和在细胞核中复制的病毒之间的进化中间体。马赛病毒科成员的另一个显著特征是存在组蛋白基因，这些基因对应着由约 20 个氨基酸的连接子连接的组蛋白对 H2B - H2A、miniH2B - H2A 和 H3 - H4。在体外，融合的组蛋白 H2B - H2A 和 H3 - H4 会组装成不稳定的核小体，类似于真核生物的核小体，但包裹约 120bp 的 DNA。这些组蛋白在后期表达，是必需的，并且在病毒粒子中高度丰富，这表明在衣壳中存在类似染色质的基因组组织形式。从那以后，在核质病毒门的另一个病毒家族 —— 水母病毒科（Mamonoviridae，原型：水母病毒（medusavirus））中也发现了核心组蛋白。水母病毒除了这 4 种组蛋白外，还编码一种类似于连接组蛋白 H1 的酸性蛋白。后者在早期表达，而 4 种核心组蛋白在后期表达，并在体外形成三核小体阵列。与马赛病毒科成员不同，水母病毒将其基因组转移到宿主细胞核中启动 DNA 复制，而粒子组装和 DNA 包装则发生在细胞核附近的细胞质中。最近，在 Vermamoeba vermiformis 上分离出了隐秘病毒（Clandestinovirus）。它与水母病毒科有一定的亲缘关系，也被证明编码 5 种组蛋白，包括融合的 H2B/H2A、H3 和 H4，以及连接组蛋白 H1。隐秘病毒的基因组（约 580kb）比水母病毒科的成员（约 380kb）大得多，其 65% 的基因是 ORFans（表 1）。隐秘病毒的感染周期发生在宿主细胞核中，新合成的病毒粒子被转移到大型液泡中，然后通过胞吐作用排出。

潘多拉病毒

随着拟菌病毒亲属的广泛分布、丰富程度和意想不到的多样性逐渐被揭示，直到 2013 年，新的潘多拉病毒科（Pandoviridae，尚未被国际病毒分类委员会（ICTV）分类）的原型才被发现和表征。

出乎意料的是，从相距遥远的地点采集的样本中同时扩增出了两种分离株，这立即表明了它们的广泛分布。从澳大利亚墨尔本附近的一个淡水池塘分离出的潘多拉甜病毒（Pandoravirus dulcis），以及从智利拉斯克鲁塞斯海洋站附近太平洋海岸的通肯河口采集的浅沉积物中分离出的潘多拉海洋病毒（Pandoravirus salinus）。在 A. castellanii 细胞培养物上扩增后，发现这两种分离株都能繁殖，并形成平均长度为 1μm、直径为 0.5μm 的异质卵形粒子群落（图 1B）。它们的复制周期持续 10 - 15 小时，从单个粒子的吞噬作用开始，到宿主细胞裂解后释放出约一百个新粒子结束。

薄切片透射电子显微镜成像显示，潘多拉病毒粒子呈长椭圆形，被一层 70nm 厚的电子致密外壳包裹，一端有一个类似小孔的开口（图 1B）。粒子内部由一层内部脂质膜分隔，电子透明，没有可见的亚结构，这与大多数二十面体病毒中观察到的紧密类核形成鲜明对比。考虑到潘多拉海洋病毒的基因组仍然是有史以来获得的最大的病毒 DNA 序列，大小为 2.47Mb，两端还有大的末端重复序列（表 1），这一特征更加令人惊讶。

尽管潘多拉病毒的基因组如此之大，与许多细菌的基因组有很大重叠，但根据利沃夫的标准，即缺乏二分裂、缺乏核糖体以及缺乏编码翻译装置的基因，潘多拉病毒仍被明确归类为病毒世界的新成员。

自发现最初的两种原型以来，使用 A. castellanii 作为细胞宿主，从非常多样的环境中分离并表征了十多种潘多拉病毒菌株。然而，除了极少数情况外，潘多拉病毒在宏基因组数据中仍然很少见，这与拟菌病毒科形成鲜明对比，这可能是由于 DNA 提取方法的偏差。

已分离（并完全测序）的潘多拉病毒都具有富含 G + C（>61%）、以 TIR 结尾的双链 DNA 线性基因组，大小范围从 2.47Mbp（潘多拉海洋病毒）到 1.6Mbp（潘多拉马赛病毒（P. massiliensis））（表 1）。出乎意料的是，通过转录组学、蛋白质组学和生物信息学分析对基因组进行严格的重新注释后发现，存在许多非编码转录本，并且显著减少了标准从头预测方法（如 Genemark）预测的蛋白质编码基因数量（例如，潘多拉海洋病毒的基因数量从 2556 个减少到 1430 个，远低于通常的每 kb 一个基因的比例）。这种在病毒中极低的编码密度是由于异常长的非翻译