fto相关破骨细胞生成通过HK1/USP14/RANK通路促进根尖牙周炎雄性大鼠牙槽骨吸收

　　

在根尖周炎（AP）的发展过程中，牙槽骨吸收（ABR）是一个关键的病理表现，且在临床上会导致 AP 患者出现与 AP 相关的牙齿脱落情况。然而，ABR 发展的潜在机制在很大程度上仍是未知的。南京医科大学附属口腔医院、南京大学医学院附属口腔医院、南京大学口腔医学研究所的研究人员发现，在 AP 雄性大鼠的牙槽骨组织以及骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）分化形成的破骨细胞（OC）中，N6 - 甲基腺苷（）的总水平有所降低，这一现象与肥胖相关蛋白（FTO）的上调有关。随后，FTO 介导的己糖激酶（HK1）去甲基化修饰增强了糖酵解途径，该途径通过泛素特异性蛋白酶 14（USP14）的去泛素化活性来稳定核因子 κB 受体激活剂（RANK）蛋白，进而促进破骨细胞生成，参与 AP 相关的 ABR 发展过程。最后，研究人员发现 Dac51（一种 FTO 抑制剂）和 2 - 脱氧 - D - 葡萄糖（2 - DG，一种 HK1 抑制剂）均表现出对破骨细胞生成的抑制活性。目前的研究揭示了破骨细胞生成相关 ABR 的分子机制，并通过调节 FTO/HK1/USP14/RANK 轴，为 AP 提供了一个治疗靶点。

AP 是一种由根管系统感染引发的炎症性疾病，也是成年人牙齿脱落的常见原因之一。除了明显的炎症外，根尖周牙槽骨吸收也是 AP 的关键病理表现，是牙齿脱落的一个危险因素。牙槽骨由破骨细胞吸收，并由成骨细胞更新。患有 AP 的牙齿周围的牙槽骨会随着破骨细胞数量的增加而被吸收，且将吸收的牙槽骨恢复到原始状态非常困难。因此，阐明破骨细胞生成的机制，并确定减轻破骨细胞介导的 ABR 以阻断 AP 发展的靶点，是研究人员在当前研究中试图解决的关键问题。

糖酵解对于细胞增殖和分化至关重要，并且已被证明通过促进 OC 增殖参与多种破骨细胞介导的骨吸收疾病，如类风湿性关节炎等。己糖激酶（HK），包括 HK1、HK2、HK3 和 HK4，是糖酵解途径中的关键酶之一，与 ATP 生成和代谢物生物合成有关。与 HK2 - 4 不同，HK1 是糖酵解最重要的酶，在哺乳动物组织中普遍表达和分布。研究人员之前报道，在人类临床 AP 组织中存在高水平的糖酵解和 HK1 表达，这表明 HK1 介导的糖酵解参与了 AP 的发展。尽管 HK1 介导的糖酵解在调节 AP 炎症进展中的作用已得到充分证实，但 HK1 介导的糖酵解与 AP 的 ABR 中破骨细胞生成之间的关系尚不清楚。

N6 - 甲基腺苷（）已被确定为真核 RNA 中最丰富和保守的内部修饰。糖酵解和 HK 表达均受修饰的调控。此外，修饰与骨质疏松症中的破骨细胞生成和 OC 诱导的骨吸收有关。FTO 是修饰的擦除剂，通过调节 RNA 稳定性参与促进破骨细胞生成。然而，FTO 去甲基化与破骨细胞生成中糖酵解调节之间的关系尚不清楚；此外，FTO 如何调节糖酵解及其在 AP 患者破骨细胞生成介导的 ABR 发展中的作用机制仍有待研究。

核因子 κB 配体受体激活剂（RANKL）/RANK 信号通路的激活被认为是破骨细胞生成的关键事件。RANKL 与 RANK 结合后，RANK 会激活多种信号通路，包括活化 T 细胞核因子（NFATc1）、基质金属蛋白酶 9（MMP9）和组织蛋白酶 K（CTSK），这些通路直接介导破骨细胞生成和破骨细胞激活。因此，RANK 的表达对于 RANKL/RANK 信号系统的运作至关重要。泛素化和去泛素化可以通过调节蛋白质的降解 / 稳定来调节众多生理过程，这需要泛素化 / 去泛素化酶的参与。OC 的分化和成熟受到泛素化和去泛素化酶的调节。众所周知，在破骨细胞生成过程中 RANK 表达会增加。然而，在破骨细胞生成过程中 RANK 的泛素化 / 去泛素化事件很有趣，并且在导致 AP 相关 ABR 的破骨细胞生成过程中，FTO、HK1 介导的糖酵解和 RANK 之间的关系在很大程度上仍然未知。

HK1 介导的糖酵解通过增强破骨细胞生成促进 ABR

为了确定参与 AP 发展过程中 ABR 的关键功能蛋白，研究人员进行了 iTRAQ 蛋白质组学分析，以研究 AP 大鼠牙槽骨组织中差异表达的蛋白质。KEGG 分析表明，代谢途径在 4 周龄 AP 大鼠的牙槽骨组织中显著富集（图 2a）。研究人员发现，HK1 蛋白作为代谢途径中糖酵解的关键酶，呈现出最显著的上升趋势（）（图 2b）。进一步分析显示，在与 AP 相关的 ABR 大鼠牙槽骨组织中，HK1 的 mRNA 和蛋白表达均呈时间依赖性显著上调（图 2c - e）。对 AP 相关 ABR 大鼠牙槽骨组织中 HK1 表达增加的免疫组织化学分析（图 2f），与在 BMDM 来源的 OC 中对 HK1 mRNA 和蛋白的分析结果一致（图 2g，h）。此外，较高水平的 HK1 蛋白分别定位于 AP 相关 ABR 大鼠牙槽骨组织和 BMDM 来源的 OC 中（图 2i，j）。HK1 是糖酵解途径中的关键酶，研究人员确实观察到在 AP 相关 ABR 大鼠模型的牙槽骨组织中，葡萄糖、乳酸、丙酮酸的水平逐渐升高，同时己糖激酶活性也相应增加（图 2k）。通过测量细胞外酸化率发现，BMDM 来源的 OC 中的糖酵解水平高于 BMDM 组（图 2l - n）。这些结果共同表明，在 AP 大鼠牙槽骨组织的破骨细胞生成过程中，HK1 依赖的糖酵解显著升高。

在本研究中，研究人员最初发现，实验性 AP 大鼠牙槽骨组织中去甲基化酶 FTO 的表达上调。从机制上讲，FTO 表达促进 HK1 表达以增强破骨细胞生成，这与 HK1 介导的糖酵解有关，并促进了 USP14 介导的 RANK 去泛素化修饰，进一步稳定了 RANK 的表达。通过使用 HK1 特异性抑制剂 2 - 脱氧 - D - 葡萄糖（2 - DG）靶向 HK1，或使用 FTO 特异性抑制剂 Dac51 靶向 FTO，结果表明这两种抑制剂均显著破坏了破骨细胞生成，这表明 FTO/HK1/USP14/RANK 轴有望成为未来治疗 AP 相关 ABR 的潜在靶点。

shHK1 和 HK1 抑制剂 2 - DG 在体外均阻断破骨细胞生成

为了进一步证实 HK1 水平升高在破骨细胞生成过程中的关键作用，研究人员使用 lenti - shHK1 和 HK 抑制剂 2 - DG 来抑制 HK1 的表达。在非细胞毒性浓度（≤0.1 mM）下，lenti - shHK1 或 2 - DG 处理显著降低了 BMDM 来源的 OC 中 HK1 以及相关生物标志物（如 NFATc1、MMP9 和 CTSK）的表达（图 3a - e）。此外，lenti - shHK1 和 2 - DG 处理均以剂量依赖性方式减少了 OC 的数量（图 3f，g）和骨吸收（图 3h，i），这与 lenti - shHK1 和 2 - DG 介导的糖酵解水平降低有关（图 3j，k）。这些数据表明，靶向抑制 HK1 可能是阻碍破骨细胞生成的有力 “武器”。

成功建立大鼠 AP 模型和 BMDM 来源的 OC 模型

为了研究 AP 相关 ABR 发展的潜在机制，研究人员最初建立了如图 1a 所示的大鼠 AP 模型。Micro - CT 扫描图像显示了大鼠牙槽骨组织在矢状面（图 1b 上）和冠状面（图 1b 下）的根尖透射区。在本研究中，观察到 AP 大鼠牙槽骨组织的骨吸收表面积和体积更大（图 1b）。ABR 的发展与破骨细胞生成有关，AP 大鼠牙槽骨组织中 OC 的数量（图 1c - d）以及破骨细胞特异性标志物（包括 NFATc1、MMP9 和 CTSK）的 mRNA 和蛋白表达均显著增加（图 1e，f）。随后，研究人员构建了源自 C57BL/6 小鼠 BMDM 的 OC，如图 1g 所示。在 1、3 和 5 天的指定时间段内，OC 的数量（图 1h）以及破骨细胞特异性标志物（包括 NFATc1、MMP9 和 CTSK）的 mRNA 和蛋白表达在 OC 中均显著增加（图 1i - k）。在本研究中，AP 大鼠牙槽骨组织中 TRAP 阳性细胞的数量在大鼠 AP 模型建立 6 周后低于 3 周，但 NFATc1、MMP9 和 CTSK 的水平仍然较高，这可能与 TRAP 检测的局限性有关。TRAP 检测仅代表抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP），这是一种在 OC 中可检测到的经典酶，是一种能够检测附着在骨吸收线上的 OC 的重要染色方法。与其他组织化学染色一样，TRAP 染色的结果取决于在单个显微镜视野中可观察到的完整分解代谢中心。目前，ABR 的表面积和体积较大，导致在单个显微镜视野中可观察到的骨吸收线长度比早期短，这可能与 TRAP 染色在单个显微镜视野中可计数的 OC 数量减少有关。总之，上述所有证据表明研究人员成功构建了大鼠 AP 模型和 BMDM 来源的 OC 模型。

靶向 HK1 表达可减轻大鼠 AP 相关的 ABR

为了研究靶向 HK1 表达是否可以减轻 AP 大鼠的 ABR，研究人员使用通过腺相关病毒（AAV9 - shHK1 - GFP）递送的大鼠巨噬细胞靶向 shHK1 - GFP 和 2 - DG 来治疗 AP 相关 ABR 大鼠（图 4a）。此外，与巨噬细胞靶向的 AAV9 - shNC - GFP 相比，AAV9 - shHK1 - GFP 显著降低了 AP 相关 ABR 大鼠牙槽骨组织中 HK1（红色）和 RANK（粉色）的表达（图 4b）。AAV9 - shHK1 - GFP 和 2 - DG 减轻了 AP 相关 ABR 大鼠牙槽骨组织中骨吸收表面积和体积的扩大（图 4c，d）。此外，在 3 周后的大鼠 AP 模型中，AAV9 - shHK1 - GFP（图 4g，h）和 2 - DG 处理组（图 4i，j）的大鼠牙槽骨组织中 OC 的数量以及破骨细胞特异性标志物（包括 NFATc1、MMP9 和 CTSK）的 mRNA 和蛋白表达均显著降低。总之，HK1 是 AP 相关 ABR 管理的潜在治疗靶点，然而，在 AP 相关 ABR 进展中 HK1 表达上调的机制在很大程度上仍然未知。

FTO 上调介导 OC 中较低水平的修饰

先前的研究表明，修饰参与破骨细胞生成；然而，修饰在 AP 相关 ABR 中的作用在很大程度上是未知的。在大鼠 AP 模型中，研究人员观察到在 1、3 和 6 周的指定时间段内，随着 AP 的发展，牙槽骨组织中总水平降低了 60 - 90%（图 5a）。并且在 1、3、5 天，OC 中的总修饰水平也降低（图 5b）。这些结果表明，总的显著降低与破骨细胞生成有关，暗示在大鼠 AP 模型的 ABR 发展中起重要作用。修饰水平的降低通常与去甲基化酶的表达有关；因此，研究人员随后测量了 FTO 和 ALKBH5（两种已知可调节去甲基化的分子）在患有 ABR 的 AP 大鼠牙槽骨组织中的表达。正如预期的那样，FTO 和 ALKBH5 的蛋白和 mRNA 水平在患有 ABR 的 AP 大鼠牙槽骨组织（图 5c，d）和 BMDM 来源的 OC（图 5e，f）中均呈时间依赖性显著上调，这意味着 FTO 和 ALKBH5 均通过调节去甲基化修饰参与 ABR 的发展。与 ALKBH5 相比，FTO 在 AP 大鼠模型的 OC 中表现出显著更高和更早的表达，表明 FTO 在 ABR 发展中可能具有更重要的作用（图 5c，e）。因此，研究人员进一步关注 FTO 表达在 AP 相关 ABR 发展中的作用，并观察到 BMDM 来源的 OC 中 FTO 蛋白表达水平高于其在 BMDM 中的表达（图 5g）。此外，FTO（绿色）主要在大鼠 AP 模型的 OC（用 RANK 抗体标记，红色）中表达（图 5h）。总之，FTO 表达介导的较低水平的修饰可能参与了 AP 相关 ABR 的发展。

shFTO 和 FTO 特异性抑制剂 Dac51 在体外均降低破骨细胞生成

为了确定 FTO 在破骨细胞生成过程中的作用，在将 BMDM 诱导分化为 OC 时，研究人员用 lenti - shFTO 或 Dac51（一种 FTO 特异性抑制剂）处理 BMDM。lenti - shFTO 显著增加了 BMDM 来源的 OC 中的总水平（图 6a）。Dac51 作为 FTO 抑制剂，在非细胞毒性浓度下也增加了 BMDM 来源的 OC 中的总水平（图 6b，c）。lenti - shFTO 和 Dac51 处理均抑制了 FTO 蛋白表达，同时下调了破骨细胞特异性标志物（包括 NFATc1、MMP9 和 CTSK）的蛋白表达（图 6d，e）。此外，用 lenti - shFTO 或 Dac51 处理减少了 BMDM 来源的 OC 的数量（图 6f，g）及其骨吸收能力（图 6h，i）。总体而言，lenti - shFTO 或 Dac51 处理导致的 FTO 表达水平降低减少了破骨细胞的形成，这表明靶向 FTO 可能通过阻碍破骨细胞生成来缓解 AP 中 ABR 的进展。

靶向 FTO 表达可减轻大鼠 AP 相关的 ABR

为了研究靶向 FTO 是否可以减轻大鼠 AP 模型中的 ABR，研究人员分别使用通过腺相关病毒（AAV9 - shFTO - GFP）递送的大鼠巨噬细胞靶向 shFTO - GFP 和 Dac51 来治疗大鼠 AP 相关 ABR（图 7a）。此外，与巨噬细胞靶向的 AAV9 - shNC - GFP 相比，AAV9 - shFTO - GFP 显著降低了 AP 相关 ABR 大鼠牙槽骨组织中 FTO（红色）和 RANK（粉色）的表达（图 7b）。有趣的是，AAV9 - shFTO 和 Dac51 均减轻了 AP 相关 ABR 大鼠牙槽骨组织中骨吸收表面积和体积的扩大（图 7c，d）。此外，AAV9 - shFTO - GFP 和 Dac51 减少了 4 周龄 AP 相关 ABR 大鼠牙槽骨组织中 OC 的数量（图 7e，f）。重要的是，在 3 周后的大鼠 AP 模型中，AAV9 - shFTO - GFP 和 Dac51 处理还增加了大鼠牙槽骨组织中的总水平（图 7g，h）。此外，在 3 周后的 AAV9 - shFTO - GFP 和 Dac51 处理组中，两种处理均降低了大鼠牙槽骨组织中破骨细胞特异性标志物（包括 NFATc1、MMP9 和 CTSK）的蛋白和 mRNA 表达（图 7i，j 和补充图 1a，b）。总之，FTO 与 HK1 类似，也是 AP 相关 ABR 管理的潜在治疗靶点，然而，在 AP 相关 ABR 进展中 FTO 和 HK1 之间的关系在很大程度上仍然未知。

FTO 通过增强 HK1 表达和 HK1 介导的糖酵解促进破骨细胞生成

几乎所有哺乳动物基因的 mRNA 都可以受到修饰的调控，包括那些编码糖酵解途径关键酶的 mRNA。从 AP 相关 ABR 大鼠牙槽骨组织中富集的 RNA 显示，HK1 转录水平上的修饰水平显著低于对照组（图 8a）。RIP 结果显示，FTO 在 AP 大鼠牙槽骨组织和 BMDM 来源的 OC 中直接与 HK1 mRNA 相互作用（图 8b，c），这意味着 FTO 可能通过调节 HK1 mRNA 上的去甲基化修饰来上调 HK1 的表达。正如预期的那样，研究人员进一步发现，FTO 过表达显著上调了 HEK - 293T 细胞中 HK1 蛋白的表达（图 8d），而 lenti - shFTO 敲低和 FTO 抑制剂 Dac51 处理均抑制了 BMDM 来源的 OC 中 HK1 蛋白的表达（图 8e，f）。甲基化 / 去甲基化修饰已被认为通过调节靶基因 mRNA 的稳定性来调控基因表达，研究人员观察到在放线菌素 D 处理期间，FTO 过表达的 HEK - 293T 细胞中 HK1 mRNA 的稳定性增强（图 8g）。为了研究 FTO 与 HK1 介导的糖酵解之间的关系，研究人员在 BMDM 来源的 OC 中进行了 ECAR 和 OCR 检测，发现 lenti - shFTO 转染或 Dac51 处理均降低了 HK1 介导的糖酵解水平，并且 lenti - shFTO 转染增加了 BMDM 来源的 OC 中的最大呼吸（图 8h - j），这意味着 FTO 抑制增加