人类和小鼠蛋白质组学揭示了阿尔茨海默病和淀粉样体延迟蛋白周转的共同途径

　　

人类和小鼠蛋白质组学揭示阿尔茨海默病的共同通路以及淀粉样蛋白组中蛋白质周转延迟

第一作者单位：美国田纳西州孟菲斯市圣犹大儿童研究医院结构生物学系
研究人员揭示，阿尔茨海默病（AD）的小鼠模型对于阐明疾病机制至关重要，但在完全反映 AD 分子复杂性方面存在局限性。在此，研究人员展示了多个淀粉样变性小鼠模型中全面的、与年龄相关的大脑蛋白质组和磷酸化蛋白质组。通过整合人类元数据，研究人员确定了共同通路，并通过多组学分析对相关成分进行了优先级排序。总体而言，两种常用模型（5xFAD 和 APP - KI）复制了 30% 的人类蛋白质改变；额外引入 tau 蛋白和剪接病理的基因后，这种相似性提高到 42%。研究人员剖析了 AD 和 5xFAD 小鼠大脑中蛋白质组 - 转录组的不一致性，发现不一致的蛋白质在淀粉样斑块微环境（淀粉样蛋白组）中富集。对 5xFAD 蛋白质组周转的分析表明，淀粉样蛋白的形成延迟了淀粉样蛋白组成分的降解，包括 Aβ 结合蛋白和自噬 / 溶酶体蛋白。研究人员的蛋白质组学策略定义了 AD 的共同通路，识别出潜在靶点，并强调蛋白质周转在 AD 进展过程中导致了蛋白质组 - 转录组的差异。

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，是痴呆最常见的病因，影响着超过 600 万美国人。AD 病理在明显的行为症状出现前几十年就已开始，其主要特征是细胞外斑块中 β - 淀粉样肽（Aβ）的聚集以及细胞内神经原纤维缠结中过度磷酸化 tau 蛋白的积累。除了 Aβ 和 tau，其他共存的分子变化，如 α - 突触核蛋白、TDP - 43 和 U1 snRNP，可能在疾病进展中发挥重要作用。对 AD 患者和对照病例的基因分析已经阐明了三个致病基因（APP、PSEN1 和 PSEN2）、高风险基因（APOE4 和 TREM2）以及约 100 个低风险基因和位点。然而，这些蛋白质 / 基因在 AD 发展中的分子机制尚未完全明确，这通常是由于缺乏合适的细胞或动物模型。

目前已经开发了 100 多种 AD 基因工程小鼠模型，主要是通过模拟与家族性 AD 相关的基因突变，如 5xFAD、3×TG 和 APP - KI（包括 APPNLF（NLF）和 APPNLCF（NLGF））等品系。然而，这些模型都无法捕捉 AD 所有的分子事件和病理变化，因为与人类患者相比，它们表现出的神经退行性变程度较轻。理想情况下，研究人员应该充分了解小鼠模型的优缺点，以便选择最合适的模型来验证特定假设；然而，目前尚无全面的相关资源。

组学技术的快速发展为在全球范围内全面评估疾病模型，并通过与人类数据进行比较来探索其相关性提供了机会。对淀粉样变性小鼠模型的转录组分析揭示了与免疫反应、突触功能和神经元信号传导相关基因的表达变化。然而，由于转录后过程，如翻译和蛋白质周转，RNA 水平并不总是与蛋白质水平一致。事实上，在 AD 和 5xFAD 小鼠中观察到转录本和蛋白质水平之间存在显著不一致。对 AD 小鼠的补充蛋白质组学研究不仅证实了转录组学的发现，还识别出了不依赖于 RNA 的蛋白质改变以及蛋白质周转的变化。这些早期对 AD 小鼠的蛋白质组学研究揭示了一些分子变化，但往往受到蛋白质组覆盖深度不足、对单个小鼠模型分析有限以及与人类 AD 数据集比较不充分的限制。

在此，研究人员对常用的 AD 模型（5xFAD、NLF 和 NLGF）中的 10369 种蛋白质（10331 个基因）和 12096 个磷酸肽（10532 个磷酸化位点）进行了深入的、与年龄相关的分析。研究人员还对另外两种 AD 模型（3xTG 和 BiG）进行了分析，进行了人类 - 小鼠比较，并分析了小鼠和人类中的转录组 - 蛋白质组不一致性。为了探索蛋白质降解对转录组 - 蛋白质组不一致性的影响，研究人员测量了 8492 种大脑蛋白质的周转速率，发现淀粉样蛋白的形成延迟了淀粉样蛋白组成分的降解。因此，研究人员的综合蛋白质组学分析确定了 AD 的共同通路，并证明了 AD 小鼠淀粉样斑块中蛋白质周转的改变。所有数据均可通过一个交互式网站免费获取和检索。

结果

多个 AD 淀粉样变性模型的蛋白质组分析揭示共同通路

研究人员比较了三种不同年龄、具有早期和晚期症状的 AD 淀粉样变性小鼠模型的蛋白质组读数（图 1a，补充数据 1）：（i）5xFAD（3 个月、6 个月、12 个月大），在 Thy1 启动子的驱动下过表达携带总共 5 个人类疾病突变的人类 APP 和 PSEN1 基因，这会促进淀粉样病理的快速发生；（ii）NLF（3 个月、12 个月大，病理较弱）和 NLGF（3 个月、6 个月、12 个月、18 个月大，病理较强），这两种都是下一代基因敲入模型，具有人源化的 Aβ 但没有基因过表达。研究人员还分析了每个小鼠品系中年龄匹配的野生型（WT）对照小鼠。

研究人员使用优化的串联质谱标签（TMT）方法，结合广泛的二维液相色谱（LC/LC）和高分辨率串联质谱（MS/MS，补充图 1a），在多个 TMT 批次中对总共 66 个小鼠大脑（皮层）进行了分析，实现了深度蛋白质组覆盖（补充数据 2）。研究人员鉴定出超过 900,000 个肽谱匹配（PSMs）、约 330,000 个肽段和 10369 种在所有动物中均存在的独特蛋白质（10331 个基因），蛋白质错误发现率（FDR）低于 0.01（图 1b，补充数据 3）。基于 TMT 报告离子进行蛋白质定量后，通过箱线图校正了样本加载偏差（补充图 1b），并通过主成分分析（PCA）对批次效应进行了归一化和确认（补充图 1c）。正如预期的那样，Aβ 胰蛋白酶肽（R.HDSGYEVHHQK.L）在所有 AD 小鼠中的水平随年龄增加，在 5xFAD 和 NLGF 中的水平高于 NLF，这与这些小鼠已报道的病理情况一致（图 1c，补充数据 4）。

为了避免不同基因型中 Aβ 损伤的混杂影响，研究人员仅使用野生型小鼠（3 个月、6 个月、12 个月、18 个月大）来研究衰老的影响。在将 3 个月大的小鼠与其他任何年龄的小鼠进行比较时，差异表达（DE）分析确定了 183 种与年龄相关的蛋白质（FDR <0.05，log?倍变化（FC）|> 两个标准差（SD）），其中 129 种蛋白质随年龄上调，54 种蛋白质随年龄下调（补充图 2a）。这些与年龄相关的蛋白质主要与细胞外基质重塑、溶酶体活性和突触信号传导等过程相关（补充数据 5）。上调的蛋白质在基因本体（GO）术语中富集，如含胶原蛋白的细胞外基质、神经元周围网络、溶酶体、谷胱甘肽代谢过程等（补充图 2b）。相反，下调的蛋白质在细胞周边、细胞连接和神经元成分（包括突触、轴突、树突棘等）中富集（补充图 2c，补充数据 6）。

然后，研究人员使用野生型对照对每个基因型在不同年龄进行差异表达分析（FDR <0.05，|log?FC|> 2 SD，补充数据 7），排除人类 Aβ 肽，因为野生型小鼠中不存在该肽。NLF 表现出较少的差异表达蛋白质（DEPs），这与它较弱的病理情况相符。相比之下，5xFAD 和 NLGF 模型表现出显著的蛋白质改变，并且在这两个模型中，这种改变都随年龄增加。例如，火山图显示 12 个月大的 NLGF 小鼠与野生型相比有 605 个差异表达蛋白质（图 1e），反映了其强烈的淀粉样表型。当汇总不同年龄的差异表达蛋白质时，5xFAD 中有 1382 个差异表达蛋白质，NLF 中只有 7 个，NLGF 中有 1142 个。此外，研究人员发现差异表达蛋白质的数量与所有测试模型中的 Aβ 积累高度相关（R = 0.86，补充数据 8）。

尽管 5xFAD 和 NLGF 模型之间存在遗传差异，但研究人员观察到这两个模型具有可比的蛋白质组特征。在 5xFAD 和 NLGF 总共 1914 个差异表达蛋白质中，有 610 个（32%）重叠，其中 98%（597/610）表现出一致的变化方向（要么上调，要么下调）。其余的差异表达蛋白质，5xFAD 中有 772 个（40%），NLGF 中有 532 个（28%），是基因型特异性的，但在两个 AD 模型中表现出相似的年龄依赖性趋势（图 1f）。差异似乎主要是由统计阈值驱动的，而不是生物学差异。总体而言，5xFAD 和 NLGF 的蛋白质组图谱表现出大致相似的模式。

研究人员对 597 个重叠的差异表达蛋白质进行了基因本体分析，发现它们在细胞外基质、溶酶体 / 内吞作用、免疫反应、突触信号传导以及与 Aβ、整合素、脂质、钙离子等的结合方面富集（图 1g，补充数据 9）。将重叠的差异表达蛋白质映射到蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络中，揭示了免疫反应、补体、脂质代谢、蛋白水解 / 自噬以及淀粉样结合细胞外基质蛋白网络（淀粉样基质体）等重要的相互作用模块（图 1h）。这些发现表明，5xFAD 和 NLGF 之间共享的蛋白质和通路对于淀粉样变性的发病机制和免疫反应至关重要，这与之前在人类 AD 中的报道一致。

AD 模型的磷酸化蛋白质组分析突出了独立于蛋白质水平的改变

由于已知蛋白质磷酸化有助于 AD 的发病机制，研究人员对相同一组 NLGF 小鼠（3 个月、6 个月、12 个月、18 个月大）、5xFAD 小鼠（12 个月大）及其年龄匹配的野生型对照进行了磷酸化蛋白质组分析。在对 NLGF 小鼠进行与年龄相关的磷酸化蛋白质组全面发现分析后，研究人员使用单一年龄的 5xFAD 小鼠作为验证模型。研究人员同样使用 TMT - LC/LC - MS/MS 方法进行分析，并增加了磷酸肽富集步骤以提高磷酸化蛋白质组的覆盖率（补充图 3a - c）。结合所有 TMT 批次的磷酸化蛋白质组数据，研究人员定量了 129,906 种独特的磷酸肽（10,502 种蛋白质上的 82,261 个磷酸化位点，肽段 FDR < 0.01，补充数据 10）。由于单个 TMT 批次中磷酸化蛋白质组的覆盖不完全，不同 TMT 批次之间的重叠通常较低。当研究人员提取所有 36 只小鼠中共享的磷酸肽时，数量降至 12,096 个磷酸肽（2814 种 5xFAD 和 NLGF 小鼠中的磷酸化蛋白质上的 10,532 个磷酸化位点，图 2a，补充数据 11）。这些共享的磷酸肽包含 8665 个 pS（82.3%）、1625 个 pT（15.4%）和 242 个 pY（2.3%）位点（图 2b），与其他大规模磷酸化蛋白质组分析中的位点分布相似。

然后，研究人员使用年龄匹配的野生型对照对 5xFAD 和 NLGF 小鼠进行成对差异表达分析，在两个小鼠模型中鉴定出 122 个一致的差异表达磷酸肽（80 个差异表达磷酸化蛋白质）（FDR <0.05，|log?FC|> 2 SD，补充数据 12）。例如，在两只小鼠中，PTPRC/CD45 S964 和 GFAP T299 的磷酸化水平均显著增加，分别表明小胶质细胞和星形胶质细胞的激活（图 2c，d）。80 个差异表达磷酸化蛋白质在细胞骨架、质膜、突触和囊泡的几个通路和蛋白质 - 蛋白质相互作用网络中富集（图 2e，2f，补充数据 13）。这些通路与人类 AD 的磷酸化蛋白质组研究中揭示的通路一致。

值得注意的是，80 个差异表达磷酸化蛋白质中只有 30 个（37.5%）在蛋白质组水平上表现出显著变化（图 2g），这表明磷酸化的差异主要是由于大脑中激酶 / 磷酸酶活性的改变，而与蛋白质水平无关。为了基于这些差异表达磷酸肽量化激酶活性的变化，研究人员通过激酶 - 底物富集分析（KSEA）的计算机算法推导了激酶家族的变化。例如，MAPK 的活性可以从其差异表达底物 TOM1L2、EML4、GJA1 和 TLE3 中推断出来（图 2h）。该分析确定了两个激酶家族的上调：酪蛋白激酶（CSNK，p = 0.031）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK，包括 p38 激酶，p = 3.65×10?11）（图 2i）。一致地，在之前的几个人类 AD 队列研究中，MAPK 通路的失调都被重点提及。因此，研究人员的 KSEA 分析表明，许多与淀粉样病理相关的激酶存在失调。

小鼠与人类 AD 差异表达蛋白质的比较

为了研究小鼠模型的相关性，研究人员将 5xFAD 和 NLGF 中的差异表达蛋白质与人类元数据进行了比较。研究人员关注在深度 AD 蛋白质组学研究中始终表现出显著变化的 866 个人类差异表达蛋白质（图 3a，补充数据 14），通过质谱在小鼠中检测到了其中 654 个同源蛋白质。5xFAD 和 NLGF 差异表达蛋白质的总和占 AD 差异表达蛋白质的 30%（196/654），并且表现出年龄依赖性（图 3b）。三个数据集共享一组核心的 108 个差异表达蛋白质（图 3c）。进一步分析表明，5xFAD 和 NLGF 的差异表达蛋白质与晚期 AD 的相关性更强（R 分别为 0.32 和 0.23），而与轻度认知障碍（MCI）的相关性较弱（R 分别为 0.00 - 0.09），尽管这两种相关性都较弱。这意味着这些小鼠模型可能更能代表晚期 AD 中的淀粉样变性，而不是早期无症状阶段（图 3d）。在一致的核心差异表达蛋白质中，大约一半表现出细胞类型特异性，其中 42% 特异性针对小胶质细胞，29% 针对神经元，25% 针对星形胶质细胞，2% 针对内皮细胞，2% 针对少突胶质细胞。这些发现强调了各种细胞类型对疾病发展的贡献，并突出了小胶质细胞的重要作用。

研究人员随后检查了在小鼠模型和人类 AD 中均一致的 108 个差异表达蛋白质（图 3e），并通过数学公式整合单个成分来推导它们的通路活性（图 3f）。几个通路的活性上调，包括淀粉样基质体、细胞迁移、补体和凝血、细胞骨架、免疫反应、整合素通路、脂质调节、代谢和蛋白质折叠 / 蛋白水解；两个通路 —— 神经发生和突触调节 —— 则下调（图 3g，补充数据 14 和 15）。

小鼠中除淀粉样变性外的其他病理增加了与 AD 的相似性

5xFAD 和 NLGF 淀粉样变性小鼠模型无法捕捉与 AD 相关的所有蛋白质组变化。这种差异可能归因于人类 AD 中存在但小鼠模型中缺失的其他病理，如 tau 蛋白病和剪接功能障碍。研究人员进一步分析了另外两种具有其他病理的 AD 小鼠模型（图 4a，补充图 4a - e，补充数据 1）：（i）3xTG，表现出淀粉样斑块和 tau 缠结病理；（ii）BiGenic（BiG）小鼠，通过将 5xFAD 与 N40K 转基因小鼠杂交产生，重现了淀粉样病理和新发现的 AD 中 U1 snRNP 剪接功能障碍。研究人员对这两种模型及其年龄匹配的对照（约 6 个月大，总共 37 个小鼠大脑）进行了分析，量化了 9780 和 10,255 种蛋白质（蛋白质 FDR <0.01）。研究人员在 3xTG 和 BiG 中分别鉴定出 1230 和 1564 个差异表达蛋白质（FDR < 0.05 且 | log?FC|> 2 SD，图 4b 和 c，补充数据 16,17），包括大量在纯淀粉样变性模型 5xFAD 和 NLGF 中未观察到的差异表达蛋白质。虽然 3xTG 与两种淀粉样变性模型之间的差异表达蛋白质重叠相对较低，但 3xTG 在通路活性变化方面表现出与淀粉样变性模型相似的趋势（补充图 5）。此外，3xTG 显示出与 tau 通路及其对 RNA 加工的下游影响相关的模型特异性差异表达蛋白质（图 4d）。同样，BiG 小鼠虽然与 5xFAD 有一些变化相同，但也显示出与 N40K 类似的 U1 snRNP 剪接成分缺陷，并且独特地表现出脂质和突触调节异常，这可能是由于淀粉样和 U1 snRNP 通路的协同作用（图 4e，补充图 6）。

为了评估小鼠模型和人类 AD 之间共享的分子变化，研究人员生成了一个 upset 图来突出差异表达蛋白质的重叠（补充图 7）。通过汇总四个小鼠模型中的所有差异表达蛋白质，与人类差异表达蛋白质的重叠增加到 42%（275/654，图 4f，补充数据 14），这表明除淀粉样斑块外的其他病理有助于