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在重复扩增疾病（REDs）研究中，为探究其扩张机制，研究人员以脆性 X 相关疾病（FXDs）小鼠胚胎干细胞（mESCs）为模型，研究 Pol θ、Rad52、Rad54l 和 Rad54b 突变对重复扩增的影响，结果发现这些突变不影响扩增，为相关疾病研究提供新方向。
在生命的遗传密码中，有一些神秘的 “小插曲” 正悄然影响着人类的健康。超过 45 种人类疾病，竟是由特定短串联阵列或微卫星序列的扩张引发，这类疾病被统称为重复扩增疾病（REDs） 。其中，脆性 X 相关疾病（FXDs）格外引人注目，它是因 X 连锁 FMR1 基因 5’非翻译区的 CGG 重复序列扩增所致。
以往研究虽发现一些错配修复因子与重复序列扩增有关，但对于其背后的分子机制，科学界仍迷雾重重。尤其是双链断裂修复（DSBR）在其中扮演何种角色，更是众说纷纭。为了揭开这层面纱，美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的研究人员开展了一项意义重大的研究。他们聚焦于 Pol θ、Rad52、Rad54l 和 Rad54b 这些在 DSBR 中至关重要的因子，试图探究它们与重复序列扩增之间的关系。最终，研究成果发表在《Scientific Reports》上，为该领域带来了新的曙光。
研究人员运用了 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，对 FXD 小鼠胚胎干细胞（mESCs）中的 Polq、Rad52、Rad54l 和 Rad54b 基因进行精准编辑。同时，借助 Western blotting 技术，检测相关蛋白的表达情况；利用 PCR 技术筛选编辑后的细胞系，并对 PCR 产物进行克隆测序，确定基因编辑效果；通过比较不同细胞系的扩增速率，评估各因子对重复序列扩增的影响。
研究结果显示，在 FXD 小鼠胚胎干细胞模型中，Pol θ、Rad52、Rad54l 和 Rad54b 的缺失对重复序列扩增无显著影响。具体如下：
- Pol θ 对扩增的影响：研究人员采用 CRISPR-Cas9 双 gRNA 策略敲除 Polq 基因外显子 4，构建 Pol θ 缺失的细胞系。实验数据表明，Pol θ 缺失的细胞系与野生型细胞系在重复序列扩增速率上并无明显差异，平均每天增加的重复数相近（野生型为 0.375 个 / 天，Pol θ 缺失型为 0.35 个 / 天，p=0.9） 。同时，对少量较大扩增事件的分析也显示，两者之间无显著差异（Fisher's 精确检验，p=0.79） 。这意味着，在该模型中，Pol θ 介导的末端连接（TMEJ）并非促进或抑制重复序列扩增的关键因素。
- RAD52 对扩增的影响：利用单 gRNA 策略构建 Rad52 基因敲除的细胞系，经 PCR、克隆测序及 Western blotting 验证后，对细胞系进行培养观察。结果发现，缺乏 RAD52 的细胞系与野生型细胞系在扩增速率上无统计学差异（p=0.83） ，野生型细胞系平均每天增加约 0.11 个重复，Rad52 敲除细胞系平均每天增加约 0.14 个重复。这表明，RAD52 参与的同源驱动修复过程，如转录相关双链断裂修复、单链退火（SSA）等，在该模型的重复序列扩增中并非必需。
- RAD54L 和 RAD54B 对扩增的影响：运用 CRISPR-Cas9 技术分别对 Rad54l 和 Rad54b 基因进行编辑，构建单敲除和双敲除细胞系。研究发现，单敲除和双敲除细胞系的扩增速率与野生型对照细胞系相近，虽双敲除细胞系扩增速率略低，但差异未达统计学显著水平（p 值范围为 0.21 - 0.83） 。这说明 RAD54L 和 RAD54B 参与的同源重组（HR）等 DSBR 途径，在该模型的重复序列扩增中也不起关键作用。
综上所述，本研究表明在 FXD 小鼠胚胎干细胞模型中，Pol θ、RAD52、RAD54L 和 RAD54B 介导的双链断裂修复途径并非重复序列扩增所必需。这一结论打破了以往的认知，为重复扩增疾病的研究开辟了新的方向。它提示研究者，应从其他角度探索重复序列扩增的机制，如寻找其他潜在的修复途径或关键因子。这对于深入理解重复扩增疾病的发病机制，开发更有效的治疗策略具有重要意义，有望为相关疾病的治疗带来新的突破。
