脆性X模型中的重复扩增与Pol θ、RAD52、RAD54或RAD54B介导的双链断裂修复无关

　　

探索重复扩增疾病机制的新进展 —— 对脆性 X 相关疾病模型中重复扩增与双链断裂修复关系的研究解读

美国国立卫生研究院国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所细胞与分子生物学实验室的 Bruce E. Hayward、Geum-Yi Kim、Carson J. Miller 等研究人员，在Scientific Reports期刊上发表了题为 “Repeat expansion in a fragile X OPEN model is independent of double strand break repair mediated by Pol θ, RAD52, RAD54 or RAD54B” 的论文。该研究对于深入理解重复扩增疾病（REDs）的发病机制具有重要意义，为后续开发针对性的治疗策略提供了关键理论依据。

一、研究背景

超过 45 种人类疾病由疾病特异性短串联阵列或微卫星序列的扩增引发，这类疾病被统称为重复扩增疾病（REDs），脆性 X 相关疾病（FXDs）便是其中之一。FXDs 由 X 连锁 FMR1 基因 5’非翻译区的 CGG 重复序列扩增导致。此前研究利用 FXD 小鼠模型，已鉴定出多个参与调控重复序列扩增的错配修复因子，且这些因子在其他 REDs 模型及人类中也有类似作用，这表明许多 REDs 可能共享相同的扩增机制，FXD 小鼠模型适用于研究该过程。

在研究重复扩增机制时，发现 LIG4（非同源末端连接（NHEJ）的关键酶）对小鼠模型中的重复扩增有保护作用，类似现象也在亨廷顿病（HD）小鼠模型中被观察到。由于扩增可发生于分裂和非分裂细胞，且 LIG4 在 NHEJ 中起重要作用，因此推测扩增过程可能涉及双链断裂（DSB）中间体或可转化为 DSB 的底物。

此外，Pol θ 参与的 theta 介导末端连接（TMEJ）途径在 DSB 修复中起重要作用，因其具备一些特殊性质，如对长 3’突出端底物的修复能力、能介导短同源序列的修复合成以及常与模板化插入相关等，曾被认为可能参与重复扩增过程。同时，RAD52、RAD54L 和 RAD54B 在多种同源驱动的修复过程中至关重要，RAD52 参与转录相关 DSB 修复、单链断裂修复及某些形式的断裂诱导复制（BIR）等，RAD54L 和 RAD54B 在同源重组（HR）中发挥作用，它们在重复扩增中的作用也有待研究。

二、研究材料与方法

（一）实验材料

研究使用了来自 FXD 小鼠模型的小鼠胚胎干细胞（mESCs），所有标准试剂和组织培养试剂与先前描述一致。实验中使用了多种商业抗体用于蛋白质检测，包括针对 RAD52、RAD54、β -actin 等的抗体，以及自制的针对 Pol θ 的抗体。

（二）实验方法

1. CRISPR - Cas9 基因编辑：利用 CRISPR - Cas9 技术对 FXD mESCs 中的 Polq、Rad52、Rad54l 和 Rad54b 基因进行编辑。针对 Polq 基因采用双引导 RNA（gRNA）策略，对其他基因使用单 gRNA 策略。通过设计特定引物（相关引物序列见表 1），在目标基因的特定外显子区域进行编辑。编辑后的细胞系通过 PCR 筛选，使用位于相邻内含子或外显子的远端引物（引物序列见表 2）进行扩增，再对 PCR 产物进行克隆和测序验证编辑效果。对于无法通过测序验证两个编辑等位基因的细胞系，使用蛋白质免疫印迹法（western blotting）确认基因产物的缺失情况。
2. 蛋白质免疫印迹法（western blotting）：使用相应抗体检测细胞提取物中目标蛋白质的表达水平。以 β -actin 作为内参，确保上样量的一致性。通过