同日α-突触核蛋白RT-QuIC种子扩增法检测突触核蛋白病生物标本

　　

加速 α- 突触核蛋白检测：当日完成的 RT-QuIC 检测技术进展

美国国立过敏与传染病研究所洛基山实验室（Laboratory of Neurological Infections and Immunity, Rocky Mountain Laboratories, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health）的 Sabiha Parveen、Parvez Alam 等研究人员在npj Biosensing期刊上发表了题为 “A same day α-synuclein RT-QuIC seed amplification assay for synucleinopathy biospecimens” 的论文。该研究开发出一种当日即可完成的 α- 突触核蛋白实时震动诱导转化（RT-QuIC）种子扩增检测方法（sdRTQuIC），这一成果对于帕金森病（PD）、路易体痴呆（DLB）等突触核蛋白病的研究、临床诊断及治疗发展具有重要意义，有望提升相关检测的实用性、成本效益及通量。

一、研究背景

神经退行性疾病是由大脑中蛋白质的错误折叠、聚集和积累所引发。其中，帕金森病和路易体痴呆等突触核蛋白病的分子病理特征为异常 α- 突触核蛋白（α-syn）的错误折叠和聚集。在这些疾病中，α- 突触核蛋白聚集体通过种子聚合和细胞间传播驱动疾病进展 。帕金森病存在较长的前驱期，运动症状出现后，多数患者在后期会发展为痴呆；路易体痴呆则认知缺陷出现更早、进展更快，是仅次于阿尔茨海默病的第二大常见痴呆病因。由于多种突触核蛋白病和其他神经退行性疾病症状存在重叠，早期进行特异性诊断颇具难度 。

实时震动诱导转化（RT-QuIC）检测作为一种种子扩增检测（SAAs）方法，利用多种病理蛋白聚集体的种子聚合机制，能够在组织、生物流体和污染表面进行超灵敏检测，为神经退行性疾病提供了病理特异性生物标志物 。此前研究已在多种生物样本中检测到病理性 α- 突触核蛋白聚集体，有助于在疾病前驱期敏感且特异地识别突触核蛋白病病例。然而，常用的 α- 突触核蛋白种子扩增检测应用于患者诊断生物样本时，通常需要≥48 小时才能完成检测，这在一定程度上限制了其在临床和研究中的应用。

二、研究材料与方法

（一）材料准备

研究使用的 α- 突触核蛋白（α-syn）蛋白通过内部纯化获得，采用含有 K23Q α-syn 蛋白载体的大肠杆菌甘油冻存液进行接种培养，经过一系列的诱导表达、细胞裂解、蛋白纯化和透析等步骤，最终获得高纯度的 α-syn 蛋白并储存备用。实验所需的大脑（DLB、PD）、皮肤（PD）、肠黏膜（PD）、脑脊液（PD）及相应对照样本，均按照先前研究方法进行收集 。样本收集后，分别对大脑、皮肤、肠黏膜进行相应的匀浆制备处理，以便后续检测分析。

（二）实验方法

1. 原始 RT-QuICR 检测：在黑色 96 孔板中进行，加入直径 0.8mm 的二氧化硅珠子，针对不同样本（大脑、皮肤、肠黏膜匀浆和脑脊液），分别添加特定体积的样本和反应混合液，反应混合液包含磷酸盐缓冲液、氯化钠、重组 α-syn、硫代黄素 T（ThT）等成分，针对脑脊液样本还添加了十二烷基硫酸钠。反应在 42℃下进行，以 400rpm 的速度双轨道振荡 1 分钟、静止 1 分钟为一个循环，每 45 分钟测量一次 ThT 荧光。

2. sdRT-QuIC 检测：同样在黑色 96 孔板中开展，添加相同规格的珠子，样本和反应混合液的添加量与原始检测类似，但反应混合液中加入了 0.1% 的 Triton X-100，且反应在 50℃下进行，振荡速度提升至 700rpm，每 45 分钟测量一次 ThT 荧光。依据相似的判定标准，当四个重复孔中至少两个孔的荧光信号超过计算阈值时，样本被判定为阳性。

3. 统计分析：运用 Student’s T 检验分析病例组和对照组之间的差异，数据变异性以平均值 ± 标准差表示，借助 GraphPad Prism 软件完成所有统计分析和绘图，将统计学显著性设定为 p<0.05 。

三、研究结果

（一）sdRT-QuIC 检测方法开发（使用脑匀浆）

研究人员选用重组 K23Q α-syn 突变体作为底物，通过比较不同盐浓度、温度、振荡速度、α-syn 单体浓度和洗涤剂（如 SDS、Triton X-100）等条件，确定了 sdRT-QuIC 的最终反应条件。对 DLB、PD 和非突触核蛋白病（NS）病例的大脑进行终点稀释分析，结果显示，用 10??稀释的脑组织作为种子时，DLB 或 PD 病例在 3 - 5 小时内 ThT 荧光迅速增加，而 NS 对照组在 12 小时内无明显增强。进一步稀释 DLB 和 PD 脑匀浆至 10??和 10??时，12 小时内四倍重复反应仍能呈 ThT 阳性。以 10??稀释的大脑计算 1/TTT（1 / 达到阈值时间）值，结果表明 PD 和 DLB 大脑的平均 1/TTT 值显著高于对照组，且随着稀释度增加，DLB 和 PD 大脑的 1/TTT 值呈剂量依赖性下降。这表明优化后的 sdRT-QuIC 检测条件能使检测动力学加快约 4 倍，同时保持与先前 α-syn RT-QuIC 检测相当的灵敏度和特异性。

（二）对 PD 和 NS 患者肠黏膜（IM）活检样本的 sdRT-QuIC 检测

对 23 例 PD 患者和 6 例 NS 对照患者的肠黏膜活检样本进行检测。终点稀释分析显示，多数 PD 肠黏膜样本在 10?3 稀释时，TTT（达到阈值时间）为 3 - 10 小时，且在 10??稀释时所有四倍重复的 sdRT-QuIC 反应均能检测到种子活性。有 1 例 PD 肠黏膜样本在 10?3 稀释时 ThT 阴性，但进一步稀释后转为阳性。所有 NS 对照样本在 10?3 - 10??稀释度下均为阴性。通过 10?3 稀释样本获得的 TTT 和 ThT 最大值，PD 肠黏膜样本与 NS 对照组存在显著差异。总体而言，sdRT-QuIC 检测在肠黏膜样本检测中的反应动力学更快，且灵敏度和特异性与先前的 RT-QuICR 检测相当。

（三）皮肤样本的 sdRT-QuIC 分析

对 PD 和 NS 病例的死后皮肤样本检测发现，PD 皮肤样本在 10?3 - 10??稀释时，所有四倍重复均呈 ThT 阳性，进一步稀释后部分重复呈阳性；而 NS 皮肤样本在 10?3 - 10??稀释度下均为阴性。PD 和 NS 皮肤样本的平均 1/TTT 和 ThT 最大值差异显著，表明 sdRT-QuIC 检测能够在 12 小时内有效区分 PD 和 NS 的皮肤样本。

（四）生前 PD 脑脊液的 sdRT-QuIC 分析

对 4 例 PD 患者和 NS 对照的生前脑脊液样本检测显示，所有 PD 脑脊液样本在 10 - 12 小时内均呈 RT-QuIC 阳性反应，而 NS 对照样本为阴性。在 ThT 动力学、1/TTT 和 ThT 最大值方面，PD 和 NS 脑脊液样本有明显区分。尽管脑脊液样本的反应动力学普遍比其他生物样本慢，平均延迟期约为 10 小时，但 sdRT-QuIC 检测仍足够灵敏，能够区分 PD 和 NS 对照的脑脊液样本。通过终点稀释分析，研究人员在仅 0.46μl 的 PD 脑脊液中检测到种子活性，与先前使用 RT-QuICR 检测另一 PD 脑脊液的结果相近。

（五）不同生物样本中相对 α-syn 种子活性

运用改良的 Spearman–K?rber 算法，研究人员比较了不同类型生物样本中的种子浓度。结果显示，DLB 大脑、PD 大脑的平均 log SD50/mg 组织值分别为 7.0 和 5.8；PD 皮肤和 PD 肠黏膜样本的 log SD50/mg 值分别为 5.3 和 5.1；脑脊液的平均 SD50/15μl 为 9（0.95 log）。这些 sdRTQuIC log SD50/mg 值与先前使用 RT-QuICR 获得的结果一致，表明不同生物样本中 α-syn 种子活性存在差异，且新检测方法与之前方法具有一致性。

四、研究结论与讨论

研究人员成功开发出一种更快的 α-syn RT-QuIC 检测方法（sdRTQuIC），用于超灵敏检测突触核蛋白病患者大脑、皮肤和肠黏膜样本中的病理性突触核蛋白种子，大多数情况下，整体检测时间可控制在约 12 小时内，脑脊液检测虽稍长但仍不到 1 天。与先前检测方法相比，该方法在保持灵敏度和特异性的同时，显著缩短了检测时间。

这一成果具有重要意义。在研究方面，加速的检测时间有助于在基础研究中更高效地测量病理性 α-syn，推动对突触核蛋白病发病机制的深入探究；在临床诊断中，快速检测能够加快诊断进程，为患者争取更及时的治疗时机，同时提高诊断效率，降低成本；在药物研发领域，有利于高通量筛选候选药物，加速新药研发进程。然而，该研究也存在一定局限性，目前仅使用了有限数量的生物样本进行测试，后续需要在更大且更复杂的样本集上进行验证，以更好地确立 sdRT-QuIC 检测在临床和研究应用中的实用性。此外，还需进一步优化检测方法，使脑脊液分析速度与其他生物样本相当，并探索其在血液、眼泪和唾液等更易获取的生物样本中的应用。