病原体效应物HaRxL10劫持生物钟成分CHE，扰乱植物发育和免疫

Fu等人描述了一种病原体效应物HaRxL10，它通过劫持时钟成分CHE来干扰其转录调节功能，从而抑制植物免疫并干扰植物发育。

　　

病原菌效应蛋白 HaRxL10 调控植物生物钟与免疫机制的研究解读

首都师范大学生命科学学院的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “A pathogen effector HaRxL10 hijacks the circadian clock component CHE to perturb both plant development and immunity” 的论文。该研究发现了首个直接靶向植物生物钟组件的病原菌效应蛋白，揭示了病原菌干扰植物生物钟和免疫的新机制，为深入理解植物与病原菌互作提供了关键理论依据，对植物抗病育种和病害防控策略的制定具有重要指导意义。

一、研究背景

植物与病原菌在长期进化过程中形成了复杂的互作关系。植物生物钟作为其免疫系统的重要组成部分，能使植物根据昼夜节律应对病原菌侵染 。环境因素如温度、湿度的昼夜变化影响病原菌的生命周期，病原菌常在环境适宜时成功定殖，而植物将免疫系统与生物钟耦合以抵御感染。已有研究表明，病原菌感染会改变植物生物钟基因的表达模式，但病原菌如何引发这些变化以及靶向的具体生物钟组件尚不清楚。

霜霉病菌（Hyaloperonospora arabidopsidis，Hpa）属于卵菌，是一种专性寄生菌，只能在活植物上生长，其与拟南芥的互作系统常被用于研究寄主与寄生物的共同进化 。Hpa 分泌效应蛋白来抑制植物防御，其中 RXLR 型效应蛋白含有保守结构域，在病原菌致病过程中发挥重要作用，但多数效应蛋白的功能未被鉴定。

二、研究材料与方法

（一）植物材料与生长条件

研究以拟南芥 Col - 0 为野生型材料，使用 che - 2 突变体及多种转基因植物。种子经表面消毒、低温处理后，在特定培养基上培养，后续转移至土壤，在 12h 光照 / 12h 黑暗、22℃条件下生长。

（二）实验方法

1. 信号肽分泌及功能验证：利用酵母系统预测并验证 HaRxL10 信号肽的分泌功能，通过转化含有 HaRxL10 信号肽与蔗糖酶基因融合载体的酵母菌株，检测其在特定培养基上的生长及蔗糖酶分泌情况。
2. 蛋白互作研究：运用酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co - IP）和 pull - down 等技术，探究 HaRxL10 与生物钟组件及其他蛋白的相互作用。
3. 蛋白稳定性及降解研究：构建相关转基因植物，通过体内外实验分析 HaRxL10 对 CHE 蛋白稳定性的影响，如细胞无细胞降解实验，观察蛋白降解情况。
4. 基因表达分析：采用 RNA 提取、逆转录定量 PCR（RT - qPCR）、RNA 测序（RNA - seq）等方法，检测基因表达水平的变化；运用酵母单杂交（Y1H）、染色质免疫沉淀 - 定量 PCR（ChIP - qPCR）和双荧光素酶报告基因检测等技术，研究基因的转录调控。
5. 病原菌感染及表型分析：利用 Pseudomonas syringae pv tomato DC3000（Pst DC3000）的三型分泌系统（TTSS）将 HaRxL10 导入植物细胞，进行细菌和卵菌感染实验，观察植物的病害表型并量化病原菌生长；同时分析植物的生理过程变化，如叶片运动、麦芽糖含量、下胚轴生长和开花时间等。

三、研究结果

（一）HaRxL10 是促进病原菌致病的效应蛋白

通过酵母蔗糖酶分泌实验证实 HaRxL10 的信号肽可介导蛋白分泌。利用 Pst DC3000 的 TTSS 系统将 HaRxL10 导入拟南芥和本氏烟草，发现其显著增强了植物对 Pst DC3000 的敏感性；过表达 HaRxL10 的拟南芥对非寄主卵菌病原菌大豆疫霉的易感性也明显增加，表明 HaRxL10 是一种强效的致病效应蛋白。

（二）HaRxL10 与 CHE 互作抑制 CHE 蛋白降解

Y2H 筛选发现 HaRxL10 与拟南芥生物钟组件 CHE 相互作用，Co - IP 和 BiFC 实验进一步验证了该互作在植物体内的存在。亚细胞定位显示 HaRxL10 定位于细胞核和细胞质，CHE 定位于细胞核，且 HaRxL10 不影响 CHE 的核定位。体内外实验表明，HaRxL10 抑制 CHE 蛋白降解，促进其积累，其 C 末端区域是稳定 CHE 蛋白的关键功能域。

（三）HaRxL10 抑制 CHE 与 ZTL 的相互作用

研究发现 CHE 稳定性受 E3 泛素连接酶 ZTL 调控，pull - down、Y2H 和 BiFC 实验证实 CHE 与 ZTL 存在相互作用 。Y3H、pull - down 和微尺度热泳动（MST）实验表明，HaRxL10 抑制 CHE 与 ZTL 的相互作用，从而稳定 CHE 蛋白，但不影响 CHE 与其他蛋白如 TOC1 的相互作用。

（四）HaRxL10 隔离 CHE 以抑制其对下游基因的转录调控作用

Y1H、ChIP - qPCR 和双荧光素酶实验证明 CHE 可正向调控自身基因表达 。然而，过表达 HaRxL10 的拟南芥中 CHE 转录本丰度降低，且 HaRxL10 及其功能域 HaRxL1037 - 221 抑制 CHE 与靶基因启动子的结合，表明 HaRxL10 通过隔离 CHE 抑制其对下游靶基因的转录调控。

（五）HaRxL10 以 CHE 依赖的方式影响 SA 相关防御基因表达，增强植物感病性

利用 Pst DC3000 介导的效应蛋白递送和转基因植物过表达两种策略，发现 HaRxL10 增强植物感病性的功能依赖于 CHE 。RNA - seq 分析表明，HaRxL10 抑制的基因与 CHE 诱导的基因显著重叠，这些基因多与 SA 响应和防御反应调节相关。RT - qPCR 验证了 HaRxL10 对相关防御基因如 ACD6、CRK4 和 PR2 表达的抑制作用，且该抑制作用在 che - 2 突变体中减弱。此外，研究还发现 CHE 可能间接调控这些基因表达，且 HaRxL10 对 SA 介导的防御调控较为复杂。

（六）HaRxL10 影响中央时钟基因和昼夜节律控制的节律基因表达

RNA - seq 和 RT - qPCR 结果显示，HaRxL10 显著抑制 CHE、TCP22 等时钟基因的表达，且对 TCP22 的抑制依赖于 CHE 。在持续光照条件下，过表达 HaRxL10 的拟南芥中，CCA1 表达降低，TOC1 表达升高，时钟输出基因 CAB2 的周期缩短。HaRxL10 还改变了昼夜节律控制基因的周期、相位和振幅分布，且部分效应依赖于 CHE。

（七）HaRxL10 以 CHE 依赖的方式影响植物生理过程

过表达 HaRxL10 的野生型拟南芥叶片运动相位延迟、麦芽糖振荡紊乱、下胚轴伸长、开花时间提前，而在 che - 2 突变体背景下，这些表型变化消失或减弱 。此外，HaRxL10 还影响植物叶片大小等发育过程，且这些效应均依赖于 CHE。

（八）HaRxL10 与多个 TCP 蛋白相互作用并影响 TCP 基因表达

Y2H 实验表明 HaRxL10 可与多个 TCP 蛋白相互作用，24 小时时间进程 RT - qPCR 分析发现，过表达 HaRxL10 影响了部分 TCP 基因如 TCP7、TCP12 的表达模式，表明 HaRxL10 可能通过靶向多个 TCP 蛋白影响植物生理过程。

四、研究结论与讨论

研究表明，卵菌病原菌 Hpa 的效应蛋白 HaRxL10 通过转录和转录后调控干扰植物生物钟组件 CHE 的功能 。HaRxL10 与 CHE 直接相互作用，破坏 CHE - ZTL 相互作用以稳定 CHE 蛋白，但抑制 CHE 与靶基因的结合，影响多个中央时钟基因表达。同时，HaRxL10 以 CHE 依赖的方式抑制 SA 相关的正防御基因、促进负防御调节基因，抑制植物免疫；还调节植物的节律过程，促进植物开花和下胚轴生长。

该研究首次揭示了病原菌效应蛋白直接靶向植物生物钟组件的机制，为理解植物与病原菌互作提供了新视角 。与病毒效应蛋白 NSs 对 CHE 的作用机制不同，HaRxL10 通过独特的方式影响植物免疫和生长发育。研究采用的 Pst DC3000 TTSS 介导的效应蛋白递送和转基因植物过表达两种方法各有优缺点，为后续研究提供了方法学参考。此外，CHE 作为植物生长和防御的关键调节因子，易受病原菌效应蛋白攻击，未来对 CHE 突变体的研究有助于探索植物如何在抵御病原菌攻击的同时维持自身正常生长和防御功能。这一研究成果对植物抗病机制的深入理解和新型病害防控策略的开发具有重要的理论和实践意义。