肉毒杆菌神经毒素A1与SV2B复合物的冷冻电镜结构揭示其跨膜转运的分子机制

本研究通过冷冻电镜技术解析了肉毒杆菌神经毒素A1(BoNT/A1)与其受体SV2B在不同pH条件下的复合物结构，揭示了BoNT/A1从半闭合构象到开放构象的动态转换机制，阐明了酸性环境下毒素跨膜转运的分子基础，为开发更高效的神经毒素疗法提供了结构依据。

　　

肉毒杆菌神经毒素(BoNTs)是已知最强大的生物毒素之一，同时也是广泛应用于医疗美容领域的重要治疗蛋白。其中BoNT/A1因其高效性和特异性成为临床主要应用亚型。然而，这种毒素如何精确识别神经元靶点并完成跨膜转运的分子机制尚不明确，特别是其构象动态变化与转运能力的关联性长期存在争议。

瑞士保罗谢勒研究所(Paul Scherrer Institute, PSI)的研究团队在《Nature Communications》发表了突破性研究成果。通过冷冻电镜技术，研究人员首次解析了全长BoNT/A1与其受体SV2B的复合物结构，捕获了毒素在生理pH和酸性pH条件下的构象变化。研究发现，游离状态的BoNT/A1呈现独特的半闭合构象，而在结合SV2B后转变为开放构象，使催化结构域(LC)和转运结构域(H_N)远离膜表面。当环境pH降低至5.5时，复合物又恢复为半闭合构象，使LC和H_N靠近膜表面，形成转运准备状态。这一发现揭示了pH依赖的构象转换是BoNT/A1跨膜转运的关键分子开关。

研究主要采用冷冻电镜单颗粒分析技术，结合分子动力学模拟和突变验证实验。通过表达纯化全长SV2B蛋白和BoNT/A1毒素，制备了不同pH条件下的复合物样本，利用300 kV冷冻电镜采集高分辨率数据，经多轮三维分类和局部重构获得3.4-5.4 ?分辨率的结构。

研究结果

BoNT/A1在溶液中呈现独特构象

冷冻电镜结构显示，游离的BoNT/A1采用不同于晶体结构的半闭合构象，其受体结合结构域(H_C)相对于晶体结构旋转约107°。这种构象与破伤风毒素在pH 5.5-6.5时的状态相似，但明显不同于BoNT/E等血清型的闭合构象。

SV2B-BoNT/A1复合物结构揭示结合模式

在3.7 ?分辨率下解析的SV2B-H_CA1复合物显示，SV2B的胞外域(LD)通过β-螺旋结构与H_CA1的凸面结合。关键的糖基化位点Asn-516通过π-CH堆积与H_CA1的F953相互作用，同时E521与H_CA1的Y1122、K1137和R1156形成盐桥网络。突变实验证实，同时破坏糖蛋白相互作用(F953G)和蛋白界面(T1145A/T1146A)会完全消除结合能力。

pH依赖的构象转换机制

在pH 5.5条件下，SV2B结合的BoNT/A1从开放构象恢复为半闭合状态。关键的螺旋连接区(F851-N880)发生重排，使LC的膜定位结构域(MLD,残基275-334)和H_N的带正电荷区域(I685-L690, Y824-K840)靠近膜表面。这种构象与游离毒素相似，但H_C取向完全不同于NTNHA结合的毒素状态。

讨论与意义

该研究首次阐明了全长BoNT/A1在转运过程中的动态构象变化：1) 生理pH下受体结合诱导的开放构象可能防止毒素在到达突触小泡前发生 premature translocation；2) 酸性pH触发的半闭合构象使LC和H_N正确定位膜表面，为后续跨膜通道形成创造条件；3) SV2B的闭合构象可能通过保守的二硫键(C141-C526)调控其潜在的转运活性。

这些发现不仅解决了长期以来关于神经毒素转运机制的争议，还为设计改良型治疗毒素提供了结构基础。特别值得注意的是，不同血清型(BoNT/A与E)的构象差异可能解释其临床作用时间的显著差别，这为开发作用时间可调控的新型神经毒素疗法指明了方向。研究揭示的SV2B结构与有机阳离子转运蛋白(OCTs)的相似性，也为探索SV2家族蛋白的生理功能提供了新视角。