从水牛乳中挖掘宝藏：枯草芽孢杆菌 BH-01 优化瓜氨酸生产的探索之旅

研究人员为优化 L - 瓜氨酸生产，从水牛乳中分离枯草芽孢杆菌 BH-01，经优化后产量达 632.5μg/L ，具潜在应用价值。

　　

研究背景：探索瓜氨酸生产的新路径

在生命的微观世界里，微生物如同隐藏的宝藏，蕴含着无限可能。L - 瓜氨酸（L-citrulline）作为一种非蛋白质氨基酸，在众多生理过程中扮演着关键角色。它不仅能参与人体代谢，对心血管健康有益，还在食品、医药和纺织等多个领域有着广泛应用 。在医药领域，它可作为治疗心血管疾病药物的前体；在食品工业中，能改善蛋白质的溶解性和消化性；在纺织业，能提升皮革产品的柔软度。

目前，瓜氨酸的生产方法多样，包括化学合成、植物提取以及微生物发酵和酶法合成。然而，化学合成存在环境污染等问题，植物提取产量有限且成本高。相比之下，微生物发酵和酶法合成因具有底物易获取、产量高、操作简单等优势，成为研究热点。但该方法也面临一些挑战，比如发酵过程受多种因素影响，导致产量不稳定，且部分生产菌株存在安全隐患。因此，寻找安全高效的瓜氨酸生产菌株，并优化其发酵条件，成为科研人员亟待解决的问题。

为攻克这些难题，来自埃及阿斯尤特大学等机构的 Marwa A. K. Mansour、Salah G. Ali、Manal A. M. Hassan 等研究人员展开了深入研究。他们从水牛乳中寻找 “潜力股” 菌株，通过一系列实验优化瓜氨酸的生产过程。相关研究成果发表在《BMC Microbiology》杂志上，为瓜氨酸的生产开辟了新方向。

研究方法：多技术联用挖掘菌株潜力

研究人员运用了多种关键技术来探索瓜氨酸生产的优化策略。在菌株分离与鉴定方面，从埃及阿斯尤特大学农业学院动物农场的水牛乳中采集样本，通过 10 倍系列稀释法在营养琼脂培养基上分离细菌，再利用 16S rRNA 基因测序技术对分离菌株进行分子鉴定，确定其种属。

为评估菌株特性，采用多种实验方法。以模拟胃液、肠液、不同温度、盐浓度、酚溶液处理菌株，测定其存活率，判断耐受性；用纸片扩散法检测菌株对 6 种致病细菌的抗菌活性以及对抗生素的敏感性。

在优化瓜氨酸生产条件时，先使用单因素实验（OFAT）研究碳源、氮源、温度和培养时间对瓜氨酸生产的影响。随后，运用 Plackett-Burman 设计筛选影响瓜氨酸生产和精氨酸脱亚胺酶（ADI）活性的关键因素，再通过 Box-Behnken 设计进一步优化这些因素，利用统计分析软件分析数据，建立模型预测产量和酶活性。

研究结果：BH-01 菌株的卓越表现

1. 菌株的分离与鉴定：研究人员从水牛乳样本中成功分离出 5 株产 ADI 的好氧细菌，其中 BH-01 菌株因在 L - 精氨酸琼脂平板上形成的粉色圈最宽，被认定为最高 ADI 产生菌。经 16S rRNA 基因序列比对和系统发育树分析，BH-01 被鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株 AUMC B-498，其 16S rRNA 基因核苷酸序列已存入 GenBank 数据库，登录号为 PP574248.1。
2. 菌株的益生菌特性：BH-01 展现出良好的益生菌特性。在模拟胃液（pH 2.0 和 4.0）中，它有一定的存活率（25.4 - 40.6%）；在模拟肠液（pH 6.0 和 7.0）中，存活率更高（65.05 - 85.9%）。对胆汁盐（0.3% 和 0.5%）、酚（0.4%）也有一定耐受性，在 2% NaCl 浓度下存活率较高。它还能耐受高达 60℃的高温，45℃时存活率最高（95.9%）。此外，BH-01 对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和肺炎链球菌均有抗菌活性，且对多种抗生素敏感。
3. 瓜氨酸生产条件的优化：通过 OFAT 实验发现，葡萄糖作为碳源、NH₄NO₃作为氮源时，瓜氨酸产量较高；温度升高会使瓜氨酸产量增加，40℃时产量最高；培养时间对产量影响不显著，5 天时不同温度下均有较高产量。

Plackett-Burman 设计实验表明，温度、L - 精氨酸、培养时间和蛋白胨是影响瓜氨酸生产和 ADI 活性的关键因素，其中 L - 精氨酸、温度和蛋白胨浓度与测试响应呈正相关，葡萄糖、酵母提取物和培养时间呈负相关。

基于这些结果，Box-Behnken 设计进一步优化得到，在 L - 精氨酸为 0.5g/L、蛋白胨为 0.5g/L、温度 35℃、培养 5 天时，瓜氨酸产量可达 632.5μg/L，ADI 活性为 1.42U/mL。

研究结论与意义：开启瓜氨酸生产新篇章

本研究成功从水牛乳中分离出枯草芽孢杆菌 BH-01，它兼具益生菌特性和高效生产瓜氨酸的能力。其在恶劣环境下的耐受性，如对酸性 pH、高胆汁盐浓度、高温的抵抗，以及对致病细菌的抑制作用，为其在食品和医药领域的应用奠定了基础。

通过 Plackett-Burman 和 Box-Behnken 设计优化发酵条件，显著提高了瓜氨酸产量和 ADI 活性，确定了关键影响因素及其最佳水平，为工业生产提供了重要参考。与其他瓜氨酸生产菌株相比，BH-01 具有安全性高、能利用低成本底物等优势，在生物技术应用中极具潜力。

该研究不仅为瓜氨酸的生产提供了新的菌株和优化策略，还为微生物发酵生产其他生物活性物质提供了借鉴。未来，有望基于此研究进一步开发相关产品，推动食品、医药和生物技术产业的发展，让这一来自水牛乳的 “宝藏” 菌株发挥更大的价值。