乳腺癌中靶向 CDK4/6 的研究
阿努莎?沙纳巴格、杰西卡?阿曼德、尤金?松、杨熙元（音译）
摘要：细胞周期机制的失调，尤其是细胞周期蛋白依赖性激酶 4 和 6（CDK4/6）的过度激活，是乳腺癌发病机制的一个标志。CDK4/6 抑制剂的引入通过有效靶向异常的细胞周期进程，改变了激素受体阳性乳腺癌的治疗格局。然而，尽管它们在初始临床应用中取得了成功，但耐药性仍然是一个重大挑战，目前尚无可靠的生物标志物来预测治疗反应或指导针对耐药群体的治疗策略。因此，众多研究致力于探究导致耐药性的机制，以优化 CDK4/6 抑制剂的治疗应用并改善患者预后。本文中，哥伦比亚大学的研究人员将研究调节细胞周期的分子机制、CDK4/6 抑制剂目前在乳腺癌治疗中的临床应用，以及导致耐药性的关键机制。此外，他们还将讨论新兴的预测生物标志物，并突出克服耐药性和提高治疗效果的潜在方向。
关键词：乳腺癌；CDK4/6 抑制剂；细胞周期；耐药机制；生物标志物
一、引言
乳腺癌是全球最常见的癌症之一，也是女性癌症相关死亡的主要原因。尽管在早期检测和治疗方面取得了显著进展，但对传统疗法的耐药性仍然是一个主要挑战，这凸显了创新治疗方法的必要性。靶向细胞周期（一个控制细胞增殖的基本过程）在癌症治疗中是一种很有前景的策略。细胞周期失调是癌症的一个标志，它驱动着不受控制的细胞分裂和肿瘤生长。
细胞周期由一系列受到严格调控的阶段组成，确保细胞在生长、DNA 复制和分裂过程中有序进行。这一过程的关键调节因子包括细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）、CDK 抑制蛋白以及视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），它们协同控制细胞周期不同阶段之间的转换。这些调节分子的改变可导致癌症中异常的细胞增殖。在 50%-60% 的乳腺癌病例中观察到细胞周期蛋白 D 的过表达，这表明 CDK4/6 过度激活。此外，细胞周期蛋白 E 的过表达、CDK4/6 的扩增以及肿瘤抑制基因（如 p53）的功能缺失（LOF）突变在乳腺癌中也很常见，这些变化会诱导异常的细胞周期进程。
乳腺癌根据以下受体的表达进行分类：激素受体（HR，即雌激素和孕激素受体）和人表皮生长因子受体 2（HER2）。CDK4/6 抑制剂已成为 HR 阳性（HR+）/HER2 阴性（HER2-）乳腺癌中很有前景的治疗药物。这些抑制剂选择性地靶向 CDK4/6，以阻止 G1 期 Rb 的磷酸化，从而阻断 G1/S 期的转换。临床试验表明，在转移性 HR+/HER2 - 乳腺癌患者的内分泌治疗中添加 CDK4/6 抑制剂，可显著改善无进展生存期（PFS）。然而，尽管取得了这些成功，但对 CDK4/6 抑制剂产生耐药性仍是一个重大挑战，这促使研究人员深入了解耐药机制并寻找新的治疗靶点。
在此，哥伦比亚大学的研究人员将讨论乳腺癌中细胞周期调控和对 CDK4/6 抑制剂耐药的分子机制。他们还将探索潜在的预测生物标志物和克服耐药性的治疗策略，概述目前在乳腺癌治疗中靶向细胞周期的研究方向。
二、细胞周期进入的机制
细胞进入细胞周期受到严格调控，以确保在所有必要条件满足时细胞才进入 S 期。在静止期，Rb 与 E2F 转录因子结合并将其隔离，以防止其活性和细胞过早进入细胞周期。在经典途径中，有丝分裂原刺激诱导细胞周期蛋白 D 的表达，细胞周期蛋白 D 与 CDK4/6 结合并激活它，形成活性的细胞周期蛋白 D-CDK4/6 复合物。活性 CDK4/6 使 Rb 磷酸化，导致 E2F 转录因子有效释放。与 Rb 相关的口袋蛋白 Rbl1（p107）和 Rbl2（p130）可募集染色质阻遏复合物，它们也是 CDK4/6 的底物。释放的 E2Fs 启动参与 S 期进入的基因转录，包括 CDK2 激活剂细胞周期蛋白 E 和 A。CDK2 的激活进一步使 Rb 以及 DNA 合成和复制所需的各种底物磷酸化，从而驱动 S 期的进入。此外，E2Fs 调节参与核苷酸生物合成的基因（如 DHFR、RRM1 和 RRM2）以及有丝分裂进程（包括 PLK1、BUB1 和 MAD2）的基因表达。
除了与细胞周期蛋白结合外，CDK4/6 的完全激活还需要其 T 环被 CDK 激活激酶（CAK）磷酸化。CAKs 由 CDK7、细胞周期蛋白 H 和组装因子 MAT1 组成。T 环的磷酸化使其从活性位点位移，从而允许形成功能性的细胞周期蛋白 - CDK - 底物复合物。CAK 还磷酸化 RNA 聚合酶 II 以调节 mRNA 转录，将细胞周期调控与转录控制联系起来。
在多种条件下，有几种调节机制可抑制 CDK4/6 的活性，如接触抑制、p53/p21 途径的激活、有丝分裂原的有限可用性以及 CDK 抑制蛋白的表达。INK4 家族的 CDK4/6 抑制剂（p16、p15、p18 和 p19）与 CDK4/6 的催化口袋结合，与细胞周期蛋白 D 竞争并阻断 CDK4/6 的激酶活性。细胞周期蛋白 D 本质上不稳定，在 G1 期结束时会发生磷酸化，这使其能够通过 CRM1 输出到细胞质中。此外，最近的全基因组筛选研究确定自噬和 Beclin 1 调节因子 1（AMBRA1）为一种 E3 连接酶衔接蛋白，它通过泛素化和蛋白酶体降解来调节细胞周期蛋白 D 的水平。Cip/Kip 家族蛋白（p21、p27 和 p57）与活性细胞周期蛋白 - CDK 复合物结合并抑制其活性，从而抑制细胞周期进程。然而，先前的研究表明，这些蛋白可以稳定细胞周期蛋白 D-CDK4/6 复合物并促进其核转位。虽然 Cip/Kip 家族蛋白通常使 CDK4/6 失活，但磷酸化的 p27 已被证明可以通过从 CDK 活性位点脱离来激活 CDK4/6。尽管如此，其他研究表明，在缺乏 p21 和 p27 的小鼠胚胎成纤维细胞以及缺乏 p21、p27 和 p57 的非转化细胞系中，CDK4/6 仍能被激活，这表明需要进一步研究 p27 磷酸化的生物学意义。
虽然 CDK4/6 通过使 Rb 磷酸化在细胞周期进入中起着核心作用，但多项研究表明，细胞在没有 CDK4/6 活性的情况下也能进行细胞周期。早期报告显示，缺乏所有细胞周期蛋白 D1-3 亚型或 CDK4/6 的小鼠仍能进行细胞增殖，并且在没有 CDK4/6 活性和 Rb 磷酸化的情况下也能启动 DNA 复制。一种可能的机制是由于细胞生长导致 Rb 浓度稀释，这有助于 CDK4/6 非依赖性的 Rb 失活。此外，最近的研究结果表明，未磷酸化的 Rb 本质上不稳定，导致蛋白质水平降低。然而，这种被动的 Rb 失活不足以完全激活 E2F，需要一个二级放大步骤。这种放大主要由全局转录增强子 c-Myc 驱动，c-Myc 通过有丝分裂原和激素信号上调。重要的是，虽然 c-Myc 过表达诱导细胞周期蛋白 D 表达以激活 CDK4/6，但在 CDK4/6 抑制下 Rb 减少后，它会放大 E2F 活性。其他研究还表明，c-Myc 过表达促进 CDK2 激活，通过非经典途径促进细胞周期进入。已鉴定出几种 E3 泛素连接酶，包括 NRBE3、SETDB1、β-TRCP1 和 UBR5，它们是 Rb 降解的介质。相比之下，其他研究未能检测到依赖泛素化的 Rb 降解；相反，他们提出 MDM2 和 TTC39B 通过不依赖泛素化、由蛋白酶体驱动的机制促进 Rb 降解。
对细胞周期进入的经典和非经典途径的全面理解凸显了细胞增殖中涉及的复杂调控网络，为治疗以细胞周期失调为特征的癌症提供了潜在的治疗靶点和策略。
三、CDK4/6 抑制剂在乳腺癌治疗中的作用
二十多年前，第一代 CDK 抑制剂（通常称为泛 CDK 抑制剂）被开发作为潜在的癌症治疗药物。然而，由于缺乏选择性，它们在临床试验中导致了严重的毒性反应并以失败告终。随着选择性 CDK4/6 抑制剂的开发，这一领域取得了突破，这些抑制剂在人类管腔型 / 雌激素受体阳性癌细胞中显示出疗效，表明它们在乳腺癌治疗中的潜在应用价值。与第一代抑制剂不同，这些小分子对 CDK4/6 具有更高的选择性，且毒性更低。CDK4/6 抑制可阻断细胞在 G1 期的周期进程并诱导细胞衰老。HR+/HER2 - 乳腺癌通常保留 Rb 功能，并通过雌激素信号激活细胞周期蛋白 D-CDK4/6 途径，对 CDK4/6 抑制最为敏感。这些抑制剂有前景的疗效引发了一系列临床试验，随后美国食品药品监督管理局（FDA）批准了三种 CDK4/6 抑制剂 —— 帕博西尼（Ibrance）、瑞博西尼（Kisqali）和阿贝西利（Verzenio），它们可与内分泌治疗联合用于治疗 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌。包括 MONARCH-3、PALOMA-1、PALOMA-2、MONALEESA-2 和 MONALEESA-7 在内的多项临床试验评估了这些抑制剂与内分泌治疗联合作为一线治疗的疗效，结果表明与内分泌单药治疗相比，无进展生存期有显著改善。与帕博西尼和瑞博西尼不同，阿贝西利因其额外的脱靶效应被批准作为单药治疗。这些有前景的结果使得 CDK4/6 抑制剂与内分泌治疗的联合成为 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌的标准治疗方案。
最近，中国国家药品监督管理局批准了达尔西利（Herngri）用于治疗 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌。DAWNA2 试验评估了达尔西利与内分泌治疗联合作为一线治疗的疗效，报告显示中位无进展生存期超过 30 个月，疾病进展风险降低了 49%。与内分泌单药治疗相比，PALOMA-3、MONARCH-2 和 MONALEESA-3 试验评估了 CDK4/6 抑制剂与内分泌治疗联合在对内分泌治疗耐药的人群中的疗效，结果表明中位无进展生存期和客观缓解率有显著改善。然而，这些试验对总生存期（OS）的影响各不相同，MONARCH-2 和 MONALEESA-3 试验显示总生存期有显著改善，而 PALOMA-3 试验显示总生存期有改善趋势，但未达到统计学意义。
CDK4/6 抑制剂在 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌中的临床成功导致其应用范围显著扩大，目前有超过 100 项临床试验正在研究 CDK4/6 抑制剂与化疗、免疫治疗或其他靶向治疗联合在不同乳腺癌亚型和其他肿瘤类型中的应用（表 1）。例如，在 HR+/HER2 + 乳腺癌中，HER2 信号通路增强了 CDK4/6 的活性，使 CDK4/6 成为一个理想的治疗靶点。六项正在进行的试验正在探索已批准的 CDK4/6 抑制剂与内分泌治疗和 / 或抗 HER2 治疗联合用于 HR+/HER2 + 转移性乳腺癌的治疗，以无进展生存期或总生存期作为主要终点（NCT03304080、NCT02947685、NCT05969184、NCT03772353、NCT05800756 和 NCT04334330）。对于三阴性乳腺癌（TNBC），四项正在进行的临床试验正在评估 FDA 批准的 CDK4/6 抑制剂作为单药治疗（NCT03979508），或与抗雄激素受体（AR）治疗联合用于 AR 阳性（AR+）人群（NCT02605486 和 NCT03090165），或与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂联合（NCT04315233）。然而，由于三阴性乳腺癌的异质性，不同体外研究的结果存在争议，一些研究报告对 CDK4/6 抑制不敏感，而另一些研究，特别是在 AR + 细胞系中，则显示出敏感性。在早期 HR + 乳腺癌中，研究人员正在探索 CDK4/6 抑制剂的潜在用途。几项使用肿瘤活检的转化研究表明，新辅助内分泌治疗联合 CDK4/6 抑制可降低 Ki67 表达并诱导细胞衰老。然而，临床数据并不一致。PENELOPE-B 和 PALLAS 试验未显示无进展生存期有显著改善。相比之下，monarchE 试验报告无进展生存期有显著改善，这使得阿贝西利辅助治疗被批准用于高危早期 HR + 乳腺癌患者（Ki67 指数 > 20%）。此外，其他四项临床试验正在评估早期 HR+/HER2 - 患者接受辅助内分泌治疗联合 CDK4/6 抑制剂时的无进展生存期（NCT02513394、NCT02764541、NCT04293393 和 NCT06341894）。值得注意的是，NATALEE 试验将评估 5000 名接受瑞博西尼治疗 3 年的患者的无进展生存期，这是这些试验中治疗持续时间最长的一项（NCT03701334）。
CDK4/6 抑制剂在乳腺癌治疗中作用的不断扩大，凸显了它们在转移性和早期疾病中的重要性，目前的研究重点是优化它们在不同乳腺癌亚型中的应用。
四、对 CDK4/6 抑制剂耐药的机制
尽管 CDK4/6 抑制剂在治疗 HR+/HER2 - 乳腺癌方面最初取得了成功，但大多数患者最终会产生耐药性，这限制了这种治疗的长期疗效。为了解决这一问题，大量研究致力于阐明导致耐药性的机制。大约 30% 对 CDK4/6 抑制剂产生耐药性的 HR+/HER2 - 乳腺癌患者会获得新的基因突变。由于 Rb 是 CDK4/6 的主要底物，Rb 的功能缺失突变是临床前模型中记录最充分的耐药机制。携带 Rb 功能缺失突变的乳腺癌细胞对 CDK4/6 抑制剂无反应，但通过重新引入野生型 Rb，这种原发性耐药可以逆转。然而，Rb 功能缺失突变在 HR+/HER2 - 乳腺癌中相对罕见，仅发生在 4.7% 的病例中。另一个值得注意的突变是 FAT1 的功能缺失突变，约 6% 的 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌中存在这种突变。FAT1 突变通过 Hippo 通路驱动 CDK6 过表达，导致形成对 CDK4/6 抑制剂耐药的 CDK6-INK4 复合物。CDK6 扩增和独特的 CDK6 复合物的形成也一直与耐药性相关。
有丝分裂原和激素信号通路诱导细胞周期蛋白 D 的表达以激活 CDK4/6，这在决定对 CDK4/6 抑制剂的敏感性方面至关重要。表现出 FGFR2 或 ERBB3 表达增加的肿瘤在接受 CDK4/6 抑制剂治疗时，无进展生存期会改善。然而，众多研究表明，有丝分裂原和激素信号与对 CDK4/6 抑制剂的耐药性有关。例如，在耐药肿瘤中经常观察到 FGFR 信号通路的扩增和 PTEN 的缺失，并且 KRAS 的改变与 HR+/HER2 - 乳腺癌中较短的无进展生存期相关。大多数促进耐药性的驱动突变存在于有丝分裂原和激素信号基因中，如 PIK3CA、ESR1、ERBB2、NF1 和 FGFR1。尽管如此，无论 ESR1 突变状态如何，乳腺癌仍可能对 CDK4/6 抑制剂产生反应，并且 PIK3CA 的改变在敏感和耐药肿瘤中均存在。这些发现表明，这些基因改变可能在促进耐药性的同时，仍允许对 CDK4/6 抑制剂产生初始反应。
大约 70% 最初对 CDK4/6 抑制剂有反应的 HR+/HER2 - 乳腺癌患者在未获得新的体细胞突变的情况下产生耐药性，这凸显了非遗传机制的作用。先前的一项研究揭示了在 HR + 乳腺癌细胞中形成了一种非经典的细胞周期蛋白 D-CDK2 复合物，通过 CDK2 的替代激活导致耐药性。已证明 AMBRA1 的缺失会促进细胞周期蛋白 D 的过表达，促进其与 CDK2 的相互作用。此外，最近的研究结果表明，未磷酸化的 Rb 本质上不稳定，会发生蛋白水解降解。虽然这种 Rb 降解可以独立于 CDK4/6 启动 E2F 激活，但它仅提供部分和低水平的 E2F 激活。全局转录放大器 c-Myc 在 CDK4/6 抑制剂耐药性的发展中起着关键作用，它会增加这种低水平的 E2F 活性。因此，在治疗前样本中，c-Myc 的表达水平而非 Rb 的水平，与 HR+/HER2 - 乳腺癌中 CDK4/6 抑制剂与内分泌治疗联合作为一线治疗的疗效呈负相关。一致的是，治疗前后循环肿瘤 DNA 分析显示，与接受安慰剂治疗的患者相比，接受阿贝西利治疗的患者中 c-Myc 扩增增加，这表明 c-Myc 扩增可能是一种潜在的耐药机制。这一发现与在对 CDK4/6 抑制剂耐药的肿瘤中频繁发现的上调 c-Myc 表达的有丝分裂原和激素信号通路突变相一致。这也可以解释为什么 PIK3CA 突变在敏感和耐药肿瘤中均存在，以及无论 ESR1 突变状态如何 CDK4/6 抑制剂都有疗效。由于激素信号通路会上调 c-Myc，这可能解释了 CDK4/6 抑制剂与内分泌治疗之间观察到的协同效应。此外，其他研究强调了 c-Myc 在代谢适应和 CDK6 过表达中的作用，这也有助于耐药性的产生。
新出现的证据表明，CDK4/6 抑制会显著改变表观
