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本综述研究发现瓦替醌（Vatiquinone）能预防铁死亡，但对线粒体疾病小鼠模型生存无显著益处。
线粒体疾病与瓦替醌研究背景
线粒体疾病是一类由编码线粒体相关因子的基因缺陷引发的疾病，在人类医学中是一大难题。它是先天性代谢缺陷的常见病因，也是神经疾病的主要遗传因素，大约每 4000 人中就有 1 人患病，但由于诊断困难，实际病例数可能更多。线粒体疾病在临床和遗传上具有多样性，超过 400 个独特基因与该疾病相关，其致病原因涵盖直接影响线粒体电子传递链（ETC）亚基的基因缺陷、参与 ETC 功能的外周基因缺陷、维持线粒体膜的酶基因缺陷以及其他线粒体过程相关基因缺陷 。
多种临床综合征由线粒体成分的遗传缺陷导致，Leigh 综合征是线粒体疾病中较为严重的一种，也是儿科常见的线粒体疾病表现形式。其特征为出生后早期发病（中位年龄约 2 岁，也有成人发病情况），伴有肌肉无力、发育不良、代谢功能障碍（如高乳酸血症）、大脑基底神经节等区域的对称性进行性坏死性病变以及癫痫发作。中枢神经系统（CNS）病变是该疾病的关键特征，会导致严重的神经缺陷，常因呼吸衰竭导致死亡。Leigh 综合征在遗传上具有异质性，已确定超过 110 个独特基因的缺陷与之相关。
目前，针对遗传线粒体疾病尚无临床有效的治疗方法，疾病管理主要是对症治疗和支持性护理。临床上常采用针对性补充疗法，如对辅酶 Q（CoQ）缺乏患者补充 CoQ，对线粒体神经胃肠脑肌病（MNGIE）/ 胸苷激酶 2（TK2）缺乏患者补充核苷，但效果不一。此外，线粒体疾病患者常服用维生素、抗氧化剂和营养补充剂的组合，即 “线粒体鸡尾酒疗法”，然而多数情况下这些方法并不能显著改变疾病进程。不过，针对氧化应激和能量代谢的药物仍是线粒体疾病临床试验的热门研究对象。
瓦替醌（Vatiquinone，曾用名 EPI - 743）是一种源自维生素 E 的化合物，由 PTC Therapeutics 公司研发（2019 年从 BioElectron Technology Corporation 收购）。它在筛选实验中被发现能抑制由谷胱甘肽耗竭诱导的细胞死亡，可有效抑制铁死亡通路。瓦替醌的作用靶点是 15 - 脂氧合酶（15 - LO），当活性氧（ROS）水平较高时，15 - LO 会驱动铁催化的脂质过氧化，其产生的过氧化脂质是铁死亡细胞死亡的信号。谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）可抑制这一细胞死亡通路，它能直接去除膜磷脂氢过氧化物。自 2012 年起，瓦替醌在美国已开展至少 19 项临床试验，主要针对患有遗传性线粒体疾病（包括 Leigh 综合征、Friedreich 共济失调（FA）、Leber 遗传性视神经病变（LHON）等）的人群，但此前尚无在动物模型中评估其疗效的研究。
研究方法
- 药物准备：瓦替醌购自 MedKoo Biosciences 公司。在细胞培养研究中，将其溶解于二甲基亚砜（DMSO）制备成储备液；用于动物腹腔注射时，溶解于无菌葵花籽油或含 5% 乙醇的 95% 葵花籽油（与他莫昔芬共注射时），储备液分装后于 - 20oC 或 - 80oC 避光保存。
- 细胞培养与处理：使用人真皮新生儿成纤维细胞（HDFs）和人胚肾 293（HEK293）细胞进行实验。细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素 - 链霉素和终浓度为 12.5mM D - 葡萄糖的低糖杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中，于 37oC、5% CO2环境下培养，达到汇合度时按 1:2 或 1:4 传代。
- 细胞活力检测：将细胞接种于 24 孔板，待细胞贴壁生长至约 50% 汇合度时，进行不同处理。处理结束后，弃去培养基，用含 Hoechst 33342 和 Ethidium homodimer 1（Ethd - 1）的 1X PBS 溶液孵育细胞 20min，然后在荧光显微镜下观察。Ethd - 1 染色阳性的细胞被判定为非存活细胞，Hoechst 33342 用于识别所有细胞核 。
- 氧化应激诱导实验
- 百草枯（Paraquat）处理：无水百草枯溶解于 1X PBS 配制成 1M 储备液，再稀释至工作浓度 5mM 和 0.5mM。瓦替醌储备液（1000X in DMSO，125μM 和 500μM）稀释后加入相应孔中，使终浓度达到 125nM 或 500nM，同时在非瓦替醌处理孔中加入等量 DMSO。分别在处理后 24、48、72、96 和 144h（成纤维细胞）或 48h（HEK293 细胞）评估细胞活力。
- RSL3 处理：无水 RSL3 溶解于 DMSO 制成 10mM 储备液。先加入含瓦替醌（或 DMSO）的培养基，1h 后更换为含不同浓度 RSL3（成纤维细胞为 0.2μM 或 2μM，HEK293 细胞为 2μM 或 10μM）和瓦替醌（或 DMSO）的培养基，24h 后评估细胞活力。
- BSO/Fe (III) Citrate 处理：将柠檬酸铁（Fe (III) C）和 L - 丁硫氨酸 - (S,R)- 亚砜亚胺（BSO）分别溶解于细胞培养基和 1XPBS 配制成储备液，再混合得到含不同浓度 BSO 和 Fe (III) C 的培养基（成纤维细胞和 HEK293 细胞均用 25μM BSO / 100μM Fe (III) C，HEK293 细胞还使用 1mM 和 5mM BSO / 2.5mM Fe (III) citrate）。细胞先与瓦替醌或 DMSO 孵育 1h，然后更换为含相应浓度 BSO/Fe (III) C 和瓦替醌或 DMSO 的培养基，分别在处理后 24h（HEK293 细胞）和 48h（成纤维细胞）评估细胞活力。
- 鱼藤酮（Rotenone）处理：鱼藤酮溶解于 DMSO，以 0.5μM 和 1μM 的浓度加入成纤维细胞和 HEK293 细胞中，同时设置有无瓦替醌处理组，在指定时间点观察细胞形态和死亡情况。
- 动物实验
- 动物伦理与饲养：所有动物实验经西雅图儿童研究所有关委员会批准，实验使用的小鼠保持标准饲养条件，每周至少 3 次评估健康参数。
- Gpx4 条件性敲除小鼠实验：将携带 loxP 位点侧翼 Gpx4 基因外显子 2 - 4 的小鼠（Gpx4 (fl/fl)）与携带他莫昔芬诱导型 Cre 重组酶的小鼠（Rosa26CreERT2）杂交，获得 Gpx4 (fl/fl)/Rosa26CreERT2 (+/+) 小鼠。在 P25 - P28 对小鼠进行他莫昔芬处理诱导 Cre 表达，从 P21 开始对小鼠腹腔注射瓦替醌或对照溶液，观察小鼠体重变化、共济失调症状和生存情况。
- Ndufs4 (-/-) 小鼠实验：Ndufs4 (+/–) 小鼠交配产生 Ndufs4 (-/-) 后代，从 P21 开始对 Ndufs4 (-/-) 小鼠腹腔注射 50mg/kg/day 瓦替醌或对照溶液，监测小鼠体重、神经症状（如前肢扣握）和生存情况，通过转棒实验评估运动能力和癫痫发作情况。
研究结果
- 瓦替醌抑制特定诱导剂导致的细胞死亡：在 HDFs 和 HEK293 细胞实验中，RSL3 可诱导细胞死亡，0.2μM 和 2μM RSL3 处理 HDFs 24h 后，分别导致约 20% 和 50% 的细胞死亡；2μM RSL3 处理 HEK293 细胞 24h 后，约 75% 的细胞死亡。而 500nM 瓦替醌能完全抑制 RSL3 诱导的细胞死亡。同样，BSO/Fe (III) C 诱导的成纤维细胞和 HEK293 细胞死亡也能被瓦替醌有效抑制 。
- 瓦替醌对百草枯诱导的细胞死亡无影响：百草枯通过在 ETC CI 产生大量 ROS 诱导细胞死亡，其诱导的细胞死亡途径为内在（线粒体）凋亡，与铁死亡不同。5mM 百草枯能显著诱导成纤维细胞和 HEK293 细胞死亡，然而瓦替醌对百草枯诱导的细胞死亡没有抑制作用，在 HEK293 细胞中，瓦替醌甚至增强了百草枯诱导的细胞死亡 。
- 瓦替醌对鱼藤酮诱导的细胞损伤无影响：鱼藤酮作为 ETC CI 的特异性抑制剂，用于模拟 ETC CI 缺陷。在成纤维细胞中，鱼藤酮处理未诱导细胞死亡，但导致细胞形态改变，由正常的纺锤形变为星状，瓦替醌对此形态改变无影响。在 HEK293 细胞中，0.5μM 鱼藤酮处理 48h 导致细胞形态改变和显著细胞死亡，瓦替醌同样对其无影响 。
- 瓦替醌对 Gpx4 缺陷小鼠的影响：在 Gpx4 条件性敲除小鼠模型中，瓦替醌（50mg/kg/day）对小鼠生存和体重减轻没有影响，但有趣的是，它似乎延迟了共济失调的发作 。
- 瓦替醌对 Ndufs4 (-/-) 小鼠模型的影响：在 Ndufs4 (-/-) 小鼠模型（Leigh 综合征模型）中，50mg/kg/day 瓦替醌对小鼠体重变化、疾病发作年龄（如前肢扣握症状出现年龄）和死亡率均无显著影响。不过，在转棒实验中，瓦替醌似乎抑制了 P30 时运动诱导的癫痫发作，但由于实验动物数量有限，差异未达到统计学意义 。
讨论
- 瓦替醌的作用特异性：本研究在两种细胞系中证实了瓦替醌能有效抑制由 GPX - 4 抑制或谷胱甘肽耗竭伴铁过载诱导的细胞死亡，但对百草枯和鱼藤酮诱导的细胞死亡或损伤没有效果，这表明瓦替醌的益处可能仅限于 GPX4/15 - LO 轴的扰动，并非有效的通用抗氧化剂或治疗 ETC CI 功能障碍的药物。
- GPX4 缺陷相关研究：GPX4 缺陷可导致 Sedaghatian 型脊柱干骺端发育异常（SSMD），Gpx4 条件性敲除小鼠模型可用于研究 GPX4 缺陷导致的疾病。在该模型中，瓦替醌在细胞实验中对 GPX4 抑制有显著效果，但在小鼠体内却对生存无影响。这可能是因为 Gpx4 完全缺失的影响超出了通过 15 - LO 诱导细胞死亡的范畴，提示 GPX4 可能具有除抑制铁死亡外的关键功能。
- Leigh 综合征相关研究：多项临床试验聚焦于瓦替醌治疗 Leigh 综合征，但在 Ndufs4 (-/-) 小鼠模型中，50mg/kg/day 瓦替醌对疾病的发生和进展没有影响。不过，瓦替醌似乎能抑制运动诱导的癫痫发作，这与临床 MIT - E 试验的结果相符，表明 15 - LO 可能是 Leigh 综合征癫痫治疗的潜在靶点，但还需要进一步研究验证 。
- 临床意义与伦理问题：在美国，瓦替醌已开展多项临床试验，但多数结果尚未公布。已有的一些小规模研究存在样本量不足、缺乏严谨性等问题，导致难以得出可靠结论。目前临床证据无法支持瓦替醌对 Leigh 综合征和线粒体疾病的有效性，但患者群体中仍存在一些乐观的看法，这可能与疾病进程的多变性以及文献中对瓦替醌的错误描述有关。此外，由于啮齿动物和人类在瓦替醌代谢方面存在差异，且瓦替醌在体内的作用机制尚未完全明确，在罕见病患者中进行实验性药物测试时需谨慎考虑伦理问题。未来的临床试验应优先选择在动物模型中显示出疗效、作用机制明确的药物，并根据药物的精确作用模式仔细选择目标人群。
