GNA11/GNAQ突变的葡萄膜黑色素瘤分泌VEGF以促进全身扩散

　　

葡萄膜黑色素瘤转移机制新解：GNA11/GNAQ 突变细胞分泌 VEGF 促进全身转移

美国伊利诺伊大学芝加哥分校医学院药理学与再生医学系以及眼科与视觉科学系的 Nguy?n Th? Thanh Nhàn、Sanjay Ganesh、Daniel E. Maidana、Michael J. Heiferman 和 Kaori H. Yamada 等研究人员，在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上发表了题为 “Uveal melanoma with a GNA11/GNAQ mutation secretes VEGF for systemic spread” 的论文。这一研究成果对于深入理解葡萄膜黑色素瘤（UM）的转移机制、开发针对性的治疗策略具有重要意义，为攻克这一致死性眼部癌症提供了关键的理论依据和潜在治疗方向。

一、研究背景

葡萄膜黑色素瘤（UM）是一种致命的眼部癌症，极易转移至肝脏，严重威胁患者生命健康。眼睛中的血管屏障在阻止 UM 转移过程中起着关键作用，然而，黑色素瘤细胞突破这一屏障并扩散出眼睛的具体机制在很大程度上仍不明确。已有研究表明，转移性 UM 肿瘤血管丰富且血管渗漏，这与过量的血管内皮生长因子（VEGF）产生密切相关。UM 通常由 GNAQ 或 GNA11 突变引发，几乎所有 UM 都携带这两种基因的突变，在此背景下，探究 UM 细胞与 VEGF 之间的关系，以及其对肿瘤转移的影响成为关键问题。

二、研究材料与方法

1. 细胞系：研究选用了 MP41（GNA11 Q209L）、92.1（GNAQ209L EIF1AXG6D）和 Mel202（GNAQQ209L/R210K, CDKN2AL65R SF3B1 R625G）等人葡萄膜黑色素瘤细胞系。这些细胞系具有不同的基因突变特征，能够代表不同类型的 UM，为研究提供了多样化的实验材料。
2. 实验模型：
   • 明胶捕获实验：将人视网膜内皮细胞（hREC）培养在生物素化明胶上形成单层，分别用 UM 培养的条件培养基（CM）、UM/EC 共培养的 CM、hREC 培养的 CM（阴性对照）或重组 VEGF - A（阳性对照）刺激 4 小时。利用 Alexa555 标记的链霉亲和素可视化渗漏区域，VE - Cadherin 染色指示内皮屏障，以此检测内皮细胞的通透性。
   • 器官芯片实验：在器官芯片中，将 UM 细胞与胶原凝胶混合置于中间通道，蓝色染色的 hREC 在胶原凝胶表面形成屏障。通过观察 UM 细胞穿过内皮屏障的迁移情况，研究其迁移能力，并测试中和 VEGF（使用阿柏西普 Aflibercept）对迁移的影响。
   • 小鼠体内实验：构建原位小鼠模型，将表达 mCherry 和 Nluc（荧光素酶）的 MP41（MP41mCherry - Nluc）注射到严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠的右眼脉络膜上腔。将荷瘤小鼠分为五组，分别为无治疗组、玻璃体内注射阿柏西普（2μg / 眼，UM 植入后一周）、玻璃体内注射载体、每日滴注 KAI（5μg / 眼）、每日滴注对照肽（5μg / 眼）。通过生物发光监测植入肿瘤的生长情况，在 UM 植入 8 周后，通过定量实时 PCR（qPCR）检测循环肿瘤细胞（CTCs）。
   
   
3. 关键技术路线：首先，利用体外细胞实验探究 UM 细胞分泌的物质对内皮细胞通透性的影响，重点研究 VEGF 的作用。接着，通过器官芯片模拟体内环境，观察 UM 细胞的跨内皮迁移情况以及 VEGF 中和后的变化。最后，借助小鼠原位模型，评估在体内环境下针对 VEGF 通路的干预措施对 UM 细胞转移的影响，主要检测指标为 CTCs 的数量。

三、研究结果

1. UM 细胞分泌的 VEGF 诱导内皮细胞通透性增加：明胶捕获实验结果显示，与阴性对照（hREC 培养的 CM）相比，所有 UM 培养的 CM、UM/EC 共培养的 CM 以及阳性对照 VEGF 均能显著增加 hREC 的渗漏面积，表明它们均可诱导内皮细胞通透性增加。而使用阿柏西普中和 VEGF 后，UM 培养的 CM 和 UM/EC 共培养的 CM 诱导的内皮细胞通透性增加的效果明显减弱，这充分说明 UM 细胞分泌的 VEGF 在诱导内皮细胞通透性方面发挥着重要作用（图 1a）。
2. 部分 UM 细胞依赖 VEGF 跨内皮迁移：在器官芯片实验中，MP41 - mCherry 在对照组中能够有效穿过内皮屏障。当在中间通道的 UM 细胞和胶原凝胶中加入阿柏西普（0.125mg/mL 或 0.5mg/mL）后，MP41 和 92.1 的跨内皮迁移受到抑制，这表明这些 UM 细胞依赖 VEGF 穿过内皮屏障。然而，Mel202 细胞的跨内皮迁移并未受到阿柏西普的影响，这提示 Mel202 细胞存在不依赖 VEGF 的迁移途径（图 1b、c）。
3. KAI 抑制 UM 细胞跨内皮迁移：KAI 是一种特异性靶向 VEGFR2 转运的新型肽。实验中，在 hREC 形成屏障的左通道中加入 KAI（10μM）或对照肽。结果显示，与对照肽处理相比，KAI 抑制 VEGFR2 转运后，MP41 的跨内皮迁移明显受阻（图 1b）。这表明 KAI 能够通过抑制 VEGFR2 转运，进而抑制 UM 细胞的跨内皮迁移。
4. KAI 减少小鼠体内 UM 细胞进入循环系统：在原位小鼠模型实验中，以 MP41 为研究对象，对荷瘤小鼠进行不同处理后检测 CTCs。结果发现，与无治疗组相比，KAI 滴眼处理组中检测到 CTCs 的小鼠数量减少（图 1d）。这一结果表明，KAI 在体内具有减少 UM 细胞进入循环系统的潜在作用，提示其可能抑制 UM 细胞的转移。

四、研究结论与讨论

1. 研究结论：本研究深入探究了 UM 细胞破坏内皮屏障并促进转移的机制。研究证实，携带 GNA11Q209L 或 GNAQ209L 突变的 UM 细胞通过分泌 VEGF 诱导内皮细胞通透性增加，从而促进 UM 细胞跨内皮迁移。携带 GNA11Q209L 或 GNAQ209L 且伴有 EIF1AXG6D 突变的 UM 细胞系对抗 VEGF 治疗反应良好，而 Mel202（携带 GNAQ209L/R210K、CDKN2A、SF3B1 R625G 突变）的跨内皮迁移不受抗 VEGF 治疗的抑制，表明其依赖其他转移途径。此外，研究还发现新型肽 KAI 在体外和体内均能抑制 UM 细胞的转移，具有潜在的治疗价值。
2. 讨论：系统使用阿柏西普治疗转移性 UM 患者的随机 2 期研究取得了一定疗效，系统性 KAI 治疗也能抑制小鼠体内循环黑色素瘤细胞的外渗。然而，抑制 VEGF 会对肿瘤生长和转移的多个方面产生影响，包括原发性肿瘤的血管生成、血管渗漏、原发性肿瘤生长、癌细胞的内渗、外渗以及在远端器官的定植等。因此，在合适的动物模型中进一步研究这些有益作用的机制以及可能出现的意外矛盾效应至关重要。本研究利用体外模型和体内脉络膜上腔注射 UM 细胞的方法，聚焦于 UM 细胞从眼睛通过眼部血管内渗的过程，展示了 KAI 对 UM 细胞进入循环系统的抑制作用。这一研究为理解 UM 转移机制提供了重要信息，为后续开发针对 UM 转移的联合治疗方案奠定了基础，有望推动 UM 治疗领域的发展，为改善患者预后带来新的希望。