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本研究聚焦于RNA-Seq数据预处理对膀胱癌亚型分类的影响，通过评估多种比对器、定量器及归一化和转换方法，揭示了数据转换在基于共识MIBC和TCGAclas等中心化分类器中的关键作用，为标准化RNA-Seq流程提供了重要依据。
在癌症研究领域，精准的分子亚型分类对于疾病预后和治疗响应至关重要。膀胱癌作为一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，其亚型分类与预后和治疗效果密切相关。然而，RNA-Seq数据预处理方法的选择对分子亚型分类的准确性和一致性有着显著影响。为此，西班牙巴塞罗那医院德尔马研究所和巴塞罗那瓦尔德希布伦肿瘤研究所的研究人员开展了一项研究，旨在评估不同RNA-Seq预处理工具和方法对膀胱癌亚型分类的影响，以期为标准化RNA-Seq流程提供科学依据，从而提高膀胱癌分子亚型分类的可靠性。
研究背景部分指出，尽管单细胞RNA测序和多组学方法等新技术为癌症分类带来了新的机遇，但RNA测序（RNA-Seq）仍然是一个强大且具有成本效益的工具，能够通过提供准确的基因表达量来实现全面的转录组分析。在膀胱癌（BC）中，亚型与预后和治疗反应相关。然而，RNA-Seq数据预处理步骤，包括读段比对、基因定量、归一化和数据转换，对下游分析的可靠性有着重要影响。
为了回答这些问题，研究人员选择了四个膀胱癌数据集（GSE148079、GSE179440、GSE186610和TCGA），并评估了十二种预处理方法组合对三种分子亚型分类器（ConsensusMIBC、LundTax和TCGAclas）的影响。研究结果表明，非对数转换数据在ConsensusMIBC和TCGAclas分类器中导致低分类率和与参考分类的低一致性，而LundTax算法对预处理变化表现出鲁棒性，无论采用何种预处理方法，都能更好地分离亚型。
在技术方法方面，研究人员采用了多种比对工具（如STAR和Hisat2）、定量方法（如featureCounts、StringTie、HTSeq）以及伪比对工具（如Kallisto和Salmon），并结合了不同的归一化和转换方法（如TMM、TPM和log2TPM）进行评估。样本数据来源于公共数据库GSE148079、GSE179440、GSE186610和TCGA。
研究结果部分指出，不同比对和定量方法在数据集中的总计数和检测基因数方面表现出一致性。STAR和Hisat2在计数方面优于伪比对工具（Kallisto和Salmon），尽管伪比对工具计数最低，但与StringTie定量器检测到的基因数相当。在膀胱癌亚型分类方面，ConsensusMIBC分类器结果显示，非对数转换数据（如rawData或TPM）导致低相关值和大量未分类样本，而对数转换数据（如log2TPM和TMM）则表现出更高的相关性。类似结果也在TCGAclas分类器中观察到，而LundTax分类器则表现出对预处理变化的稳定性。此外，研究人员还评估了不同分类器的分数分布和分子亚型之间的转换关系，发现LundTax分类器对对数转换不敏感，并且在不同方法中表现出更稳定的指标。
在结论和讨论部分，研究人员强调，评估RNA-Seq预处理工具对标准化RNA-Seq流程至关重要，从而最大化膀胱癌分子亚型分类的可靠性。研究结果表明，预处理步骤，包括读段比对、基因定量、归一化和数据转换，对膀胱癌分子亚型的下游分析有显著影响。特别是对于基于中心的分类器（如ConsensusMIBC和TCGAclas），对数转换是必需的，因为这些分类器对数据分布高度敏感。相比之下，LundTax分类器由于采用随机森林算法，对对数转换不敏感。此外，研究还发现，尽管伪比对工具（Kallisto和Salmon）识别的基因数较少，但这并不影响亚型分类的准确性。研究人员建议，未来的研究应集中在验证本研究结果的稳健性和可扩展性，并将其应用于其他癌症类型的分子分类器。标准化的流程将有助于提高分子亚型分类在癌症研究中的应用，促进个性化治疗策略在临床实践中的发展。
