长双歧杆菌nsp001衍生的细胞外囊泡通过调节肠道微生物群依赖方式的T细胞反应来改善溃疡性结肠炎

　　

长双歧杆菌 NSP001 来源的细胞外囊泡对溃疡性结肠炎的改善作用研究解读

南昌大学食品科学与资源国家重点实验室的 Xinke Nie、Qiqiong Li 等研究人员在npj Biofilms and Microbiomes期刊上发表了题为 “Bifidobacterium longum NSP001-derived extracellular vesicles ameliorate ulcerative colitis by modulating T cell responses in gut microbiota-(in) dependent manners” 的论文。该研究首次探究了长双歧杆菌 NSP001 来源的细胞外囊泡（NEVs）对溃疡性结肠炎（UC）相关肠道炎症的治疗作用，为 UC 的治疗提供了新的潜在生物制剂和理论依据，在肠道疾病治疗领域具有重要意义。

一、研究背景

UC 是一种慢性、免疫介导的非特异性炎症性肠病，涉及遗传、环境、微生物群和免疫反应之间的复杂相互作用。目前临床治疗主要依赖免疫抑制剂、氨基水杨酸和糖皮质激素药物，但长期使用会导致耐药性、潜在毒性和患者免疫抵抗力下降等问题，因此迫切需要开发先进的治疗策略。

益生菌可改善结肠炎症，例如肠乳杆菌通过抑制 SAA1/2 的产生来抑制 Th17 细胞，从而减轻 UC；罗伊氏乳杆菌通过改善肠道微生物群失调、保护肠道黏膜屏障和调节免疫反应来减轻肠道炎症。然而，健康个体中肠道共生细菌无法直接与肠道上皮细胞或固有层免疫细胞相互作用，其与宿主之间如何建立通信成为关键问题。

研究表明，细菌细胞外囊泡（bEVs）在介导微生物群与宿主之间的通信中起重要作用，如抑制病原体、增强肠道屏障完整性和调节免疫反应等。一些肠道共生细菌如丁酸梭菌、普拉梭菌和嗜黏蛋白阿克曼菌来源的 bEVs 已被发现可减轻 UC 小鼠的症状。长双歧杆菌作为肠道中的优势细菌，具有良好的抗炎和免疫调节活性，但其调节肠道黏膜屏障和免疫反应的机制尚未完全明确，本研究旨在确定长双歧杆菌 NSP001 对 UC 的改善作用是否由其释放的 bEVs 介导。

二、研究材料与方法

（一）材料

长双歧杆菌 NSP001 来自南昌大学食品科学与资源国家重点实验室，实验小鼠为 6 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠，购自 Charles River（北京，中国）。实验中使用的主要试剂包括 MRS 肉汤培养基、PBS、细胞计数试剂盒 - 8（CCK - 8）、AF647 染料、LPS 等。

（二）方法

1. NEVs 的提取与鉴定：将长双歧杆菌 NSP001 在厌氧条件下培养，通过离心、过滤和超速离心获取 NEVs，使用透射电子显微镜（TEM）和 Zetaview 分析其形态和粒径。

2. 细胞实验：采用 CCK - 8 法评估 NEVs 对 RAW264.7 和 Caco - 2 细胞活力的影响，通过细胞摄取实验观察 NEVs 被细胞内化的情况，利用巨噬细胞极化分析检测 NEVs 对巨噬细胞分化的影响。

3. 动物实验：建立 DSS 诱导的小鼠 UC 模型，将小鼠分为对照组、模型组和 NEVs 治疗组，记录小鼠体重、粪便情况并进行疾病活动指数（DAI）评分。实验结束后，采集血液、结肠、盲肠内容物等样本进行后续分析。同时，使用伪无菌小鼠探究 NEVs 对 UC 的改善作用是否依赖于肠道微生物群。

4. 检测指标与方法：通过多种实验方法检测相关指标，如用免疫荧光、免疫组化、Western Blot 等方法检测蛋白表达；用实时定量 PCR（RT - qPCR）检测基因表达；用酶联免疫吸附测定（ELISA）和细胞因子微阵列测定检测细胞因子水平；用气相色谱法检测短链脂肪酸（SCFAs）含量；用 16S - rRNA 测序分析肠道微生物群组成。

（三）技术路线

本研究首先提取长双歧杆菌 NSP001 来源的 NEVs 并对其进行鉴定，然后通过体外实验评估 NEVs 的生物相容性、抗炎症活性以及对巨噬细胞极化的影响。在体内实验中，利用 DSS 诱导的小鼠 UC 模型，研究 NEVs 对结肠炎严重程度、肠道屏障功能、免疫调节、肠道微生物群组成和 SCFAs 产生的影响。最后，使用伪无菌小鼠模型，探究 NEVs 改善 UC 的作用是否依赖于肠道微生物群。

三、研究结果

（一）NEVs 具有良好的生物相容性

通过体外模拟消化系统实验，发现各种消化液不影响 NEVs 的形态和粒径，且未观察到明显的膜碎片。CCK - 8 实验表明，5 - 100 μg/mL 的 NEVs 不影响 RAW264.7 和 Caco - 2 细胞的活力。细胞摄取实验显示，AF647 标记的 NEVs 可被 RAW264.7 和 Caco - 2 细胞成功内化，内化效率分别为 95% 和 92.6%。

（二）NEVs 的体内分布

给小鼠灌胃 AF647 标记的 NEVs 后进行活体成像实验，结果显示 NEVs 在胃肠道中的荧光信号在灌胃 12 h 后逐渐减弱，18 h 时在结肠中的荧光强度最高，且在其他器官中无明显荧光信号。与正常小鼠相比，DSS 诱导的结肠炎小鼠在口服 AF647 标记的 NEVs 18 h 后，胃肠道和结肠中的荧光强度分别增加了 2.4 倍和 1.4 倍，表明 NEVs 可选择性地在炎症病变部位积累。此外，在 DSS 诱导的结肠炎小鼠中，肠道免疫细胞对 NEVs 的摄取增加，T 细胞（CD4?）、中性粒细胞（Ly6G?）和巨噬细胞（F4/80?）中 AF647 阳性细胞的比例分别比正常小鼠高 7.5 倍、7.4 倍和 5.6 倍。

（三）NEVs 减轻 DSS 诱导的结肠炎严重程度

体外实验中，NEVs 抑制了 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞中 M1 型巨噬细胞的产生和相关促炎细胞因子 IL - 6 和 TNF - α 的分泌，表明 NEVs 具有良好的体外抗炎活性。体内实验中，NEVs 治疗显著防止了 DSS 诱导的结肠炎小鼠体重下降、DAI 升高和结肠缩短，逆转了脾脏指数的增加，有效改善了结肠的病理形态，阻止了炎症细胞的迁移。

（四）NEVs 改善 DSS 诱导的结肠炎小鼠的肠道屏障破坏

AB - PAS 染色结果显示，NEVs 治疗显著逆转了 DSS 诱导的结肠炎小鼠中杯状细胞数量的减少。免疫组化和 Western Blot 结果表明，NEVs 促进了 MUC2 的产生，恢复了紧密连接蛋白 ZO - 1 和 OCCLUDIN 的水平，在基因水平也观察到了与蛋白水平一致的趋势，证明 NEVs 有效恢复了肠道屏障功能。

（五）NEVs 改善结肠炎与免疫调节相关

免疫荧光结果显示，NEVs 灌胃后 DSS 诱导的结肠炎小鼠中巨噬细胞数量减少，同时 NEVs 抑制了 M1 相关促炎细胞因子 IL - 1β、TNF - α 和 IL - 6 的产生。免疫组化结果表明，NEVs 治疗减少了 Th17 细胞的数量，增加了 Tregs 的频率，促进了 Tregs 相关抗炎细胞因子 IL - 10 和 TGF - β 的表达。此外，NEVs 治疗抑制了 MPO 活性，降低了血浆中促炎细胞因子 IL - 17A、TNF - β 和 IL - 6 的水平，抑制了 STAT3 的磷酸化，调节了免疫失调，恢复了免疫功能。

（六）NEVs 调节 DSS 诱导的结肠炎小鼠的肠道微生物群组成和 SCFAs 产生

对小鼠肠道微生物群的分析表明，DSS 处理影响了肠道微生物群的组成，口服 NEVs 可在一定程度上改变其组成。在门水平上，DSS 处理导致芽孢杆菌门、变形菌门和疣微菌门的丰度增加，拟杆菌门的丰度减少，而 NEVs 处理后拟杆菌门的比例显著增加。在属水平上，DSS 诱导的结肠炎小鼠中 Allobaculum 和 Oscillospira 的丰度增加，乳杆菌属和双歧杆菌属的丰度减少，NEVs 处理后 Allobaculum 的丰度降低，Turicibacter 的丰度增加。此外，NEVs 促进了 SCFAs 的产生，Spearman 分析表明，在门水平上，拟杆菌门与异丁酸和戊酸的产生呈显著正相关，变形菌门和疣微菌门与 SCFAs 的产生呈负相关；在属水平上，Adlercreutzia 与 SCFAs 呈显著正相关，Oscillospira 和 LachnospiraceaeClostridium 与 SCFAs 的产生呈负相关。

（七）NEVs 在肠道微生物群耗竭的情况下改善 DSS 诱导的结肠炎小鼠的炎症

使用伪无菌小鼠实验发现，即使在肠道微生物群耗竭的情况下，NEVs 处理仍能防止 DSS 诱导的结肠炎小鼠体重减轻、DAI 升高、脾脏指数升高和结肠缩短，改善结肠的病理形态，增加杯状细胞数量，促进 MUC2 的表达，提高紧密连接蛋白的表达，表明 NEVs 可改善肠道屏障损伤。

（八）NEVs 在肠道微生物群耗竭的情况下调节免疫细胞的分化

在肠道微生物群耗竭的小鼠中，免疫荧光和免疫组化结果显示，NEVs 处理减少了巨噬细胞的数量，增加了 Treg 细胞的数量，减少了 Th17 细胞的数量。流式分析表明，NEVs 显著促进了脾脏中 Tregs 细胞的产生。同时，NEVs 处理降低了 IL - 6、MPO、IL - 1β 和 TNF - α 的水平，增加了 IL - 10 和 TGF - β 的水平，表明 NEVs 可影响免疫细胞的分化和相关炎症细胞因子的分泌。

四、研究结论与讨论

本研究首次证实长双歧杆菌 NSP001 来源的 NEVs 可通过改善肠道屏障损伤、调节免疫细胞分化和促进 SCFAs 产生来减轻小鼠肠道炎症，且其抗炎作用不依赖于肠道微生物群。这一发现支持了肠道细菌来源的 bEVs 可穿过无菌的内黏液层直接与宿主固有免疫细胞相互作用，引发下游反应和生理效应的假设。

研究人员通过体外模拟消化系统实验和体内成像实验，探究了 NEVs 的口服稳定性和体内分布，发现 NEVs 在恶劣的消化条件下仍能保持稳定，并选择性地在炎症结肠中积累。在细胞和动物实验中，研究了 NEVs 对巨噬细胞极化、肠道屏障功能、免疫细胞分化、肠道微生物群组成和 SCFAs 产生的影响，揭示了 NEVs 改善 UC 的多种机制。此外，通过伪无菌小鼠实验，明确了 NEVs 的抗炎作用不依赖于肠道微生物群。

然而，本研究仍存在一些局限性。虽然证实了 NEVs 的治疗效果和部分机制，但对于 NEVs 中发挥抗炎作用的具体物质以及 NEVs 进入宿主细胞的机制尚需进一步深入研究。未来的研究可以针对这些方面展开，以更全面地了解 NEVs 治疗 UC 的作用机制，为其临床应用提供更坚实的理论基础。

总体而言，本研究提供了一种天然无毒的纳米囊泡 NEVs，其有望成为一种新型的后生元制剂，用于临床预防和治疗 UC，为 UC 的治疗开辟了新的方向，具有重要的临床应用前景和科学研究价值。