通过化学水解和工程恶臭假单胞菌对聚酰胺进行升级再利用

　　

微生物转化聚酰胺：废塑循环新突破

德国于利希研究中心（Forschungszentrum Jülich）的 Jan de Witt、Tom Luthe 等研究人员在《Nature Microbiology》期刊上发表了题为 “Upcycling of polyamides through chemical hydrolysis and engineered Pseudomonas putida” 的论文。该研究通过代谢工程改造恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），实现聚酰胺单体和水解产物的微生物升级循环利用，为解决聚酰胺塑料回收难题提供了新方向，对推动塑料可持续发展意义重大。

一、研究背景

全球塑料产量持续攀升，2022 年达约 4 亿吨，其中脂肪族聚酰胺（PA），即尼龙，因其高强度和耐用性，广泛应用于纺织、汽车等领域，产量也即将达到 1000 万吨 。然而，PA 的回收现状不容乐观，回收利用率极低，如 PA 纤维回收不足 2%，多数 PA 材料被填埋或焚烧。传统回收方式，像化学回收会产生单体和低聚物混合物，分离困难，成本高昂；机械回收则需要高纯度原料，且会降低产品质量。因此，开发高效的 PA 回收策略迫在眉睫。

将化学水解与生物催化相结合，有望实现 PA 复杂水解产物的代谢汇集，并转化为高附加值产品，避免繁琐的纯化步骤。但目前缺乏能将 PA 水解产物转化为高附加值产品的微生物宿主，虽然部分微生物能代谢 PA 相关单体或低聚物，但大多局限于特定底物，且未与产品形成关联。恶臭假单胞菌 P. putida KT2440 虽能代谢多种塑料单体并生产高附加值化合物，但无法代谢 PA 相关底物，限制了其在 PA 回收中的应用。

二、研究材料与方法

（一）菌株与培养条件

研究选用 P. putida KT2440 及其衍生菌株，在 4 倍缓冲的 MSM 培养基中培养。预培养使用含 20mM 葡萄糖的 2 倍缓冲 MSM 培养基，培养至稳定期后用于后续实验。通过 Growth Profiler 960 监测菌株生长，以特定底物（如 HMDA、Ahx 等）配置培养基，研究菌株利用底物生长情况。

（二）质粒克隆与菌株工程

采用多种分子生物学技术进行菌株改造。用特定试剂盒提取基因组 DNA，PCR 扩增目的片段，通过 Gibson assembly 或 Golden Gate Assembly 构建质粒。利用同源重组或 CRISPR/nCas9 辅助的多重胞苷碱基编辑技术，对菌株基因进行靶向修饰、敲除或整合，构建所需菌株。

（三）全基因组测序与 RNA 测序

对筛选的菌株进行全基因组测序，用特定试剂盒制备测序文库，在 MiSeq 系统上测序，数据经 CLC Genomic Workbench 软件处理分析突变。RNA 测序时，收集特定生长阶段的菌株细胞提取总 RNA，由 Genewiz 测序，通过 CLC Genomics Workbench v.20 进行转录组分析，鉴定差异表达基因。

（四）高效液相色谱分析与产品分析

通过高效液相色谱（HPLC）分析底物和产物。对线性含胺底物柱前衍生化后，用特定色谱柱和流动相分离检测；对环状 Ahx 低聚物，用另一色谱柱和检测条件分析。采用酸性甲醇 ysis 和气相色谱（GC）分析定量聚羟基丁酸酯（PHB）；用分光光度法和薄层层析（TLC）测定紫罗精；通过 TLC 检测表面活性素 serrawettin W1。

（五）其他方法

制备 PA6 可溶性组分和水解产物，进行体外酶活测定实验。利用多种生物信息学工具，如 SAPPHIRE、InterPro 等进行启动子预测、蛋白结构域分析等 。

三、研究技术路线

以实验室进化为指导，对 P. putida KT2440 进行深度代谢工程改造。以能代谢己二酸（AA）的 P. putida KT2440 - AA 为起始菌株，通过适应性实验室进化（ALE）筛选能代谢 PA 单体（HMDA、Ahx 和 ε - 己内酰胺）的突变株。对突变株进行全基因组测序，鉴定关键突变基因，反向工程验证突变对菌株代谢的影响。转录组分析揭示 PA 单体代谢途径和关键调控因子。引入来自 P. ureafaciens 的尼龙酶基因，使菌株能够代谢 PA 低聚物。构建工程菌株 P. putida NYLON - ABC，导入 phaCAB 基因实现从 PA6 水解产物生产 PHB，验证微生物升级循环利用 PA6 的可行性。

四、研究结果

（一）实现 PA 单体代谢

1. 筛选代谢 PA 单体的突变株：P. putida KT2440 - AA 最初不能以 HMDA 为唯一碳源生长，经长期培养筛选出 HMDA - 1 突变株，其能代谢 HMDA、Ahx 和 ε - 己内酰胺。全基因组测序发现该突变株 PP_2884 基因发生 9bp 缺失，导致转录调节因子 DNA 结合域 3 个氨基酸缺失。构建相关敲除突变株，证实该转录调节因子为阻遏蛋白 。

2. 优化代谢 PA 单体的菌株：对 PP_2884Δ3 菌株以 Ahx 为底物进行 ALE，筛选出 Ahx - 194 突变株，其生长更快。测序发现 PP_0409 基因单核苷酸变异，将该突变引入 P. putida KT2440 - AA PP_2884Δ3 构建出 P. putida NYL，该菌株在多种 PA 单体上生长良好，验证了反向工程成功。

3. 解析 PA 单体代谢途径：通过 RNA - seq 比较不同菌株转录组，发现 P. putida NYL 中多个与 PA 单体代谢相关基因上调，包括编码转运蛋白、转氨酶和参与 γ - 谷氨酰化途径的基因。基因敲除和体外酶活实验证实，PA 单体通过直接转氨和 γ - 谷氨酰化途径代谢，经 AA 进入中心碳代谢 。

（二）实现 PA 低聚物代谢

1. 赋予菌株代谢线性 PA 低聚物能力：在 P. putida NYL 中表达来自 P. ureafaciens 的 NylABC 酶，使菌株能代谢 PA6 二聚体和三聚体。对表达 NylB 的菌株进行 ALE，筛选出生长更快的突变株。全基因组测序确定关键突变位点，反向工程构建出 P. putida NYLON - B，该菌株能高效代谢线性 Ahx 低聚物，证实相关突变对低聚物代谢的重要性。

2. 探究菌株代谢环状 PA 低聚物能力：构建表达不同尼龙酶的菌株，发现 P. putida NYLON - ABC 能代谢环状 Ahx 二聚体，但不能代谢更大的环状低聚物，体外实验表明 NylC 可能无活性。

（三）PA6 水解产物的微生物升级循环利用

1. 工程菌株生产 PHB：向 P. putida NYLON - ABC 中引入 phaCAB 基因，敲除自身 pha 操纵子，构建 P. putida NYLON - PHB。该菌株能以 PA6 单体为碳氮源生产 PHB，以 Ahx 为底物时，PHB 产量达 7.7 ± 0.2%（g PHB/g CDW） 。

2. 利用 PA6 水解产物生产 PHB：酸水解 PA6 得到含 Ahx 和线性 Ahx 低聚物的水解产物，P. putida NYLON - PHB 能在 48h 内代谢该水解产物，生长至 OD600 为 5.75，细胞内 PHB 含量达 7.0 ± 0.3%（g PHB/g CDW），与使用纯 Ahx 效果相当。同时，该菌株还能利用 PA6 水解产物生产紫罗精和 serrawettin W1，证明 PA 水解产物可作为生物技术原料 。

五、研究结论与讨论

研究人员通过实验室进化和代谢工程，成功改造 P. putida KT2440，构建出能代谢多种 PA 单体和低聚物的工程菌株 P. putida NYLON - ABC。RNA - seq 解析了 PA 单体代谢途径，明确关键调控因子和转运蛋白。利用该工程菌株实现从 PA6 水解产物生产 PHB、紫罗精和 serrawettin W1，确立了 PA 水解产物作为生物技术原料的潜力，为 PA 废料（如渔网、衣物等）提供了新的回收方案 。

与传统回收方法相比，该策略结合化学水解和微生物升级循环，避免复杂的单体分离步骤，能直接将复杂水解产物转化为高附加值产品。不过，目前该技术仍面临挑战。一方面，P. putida NYLON 的底物范围局限于 PA 低聚物，化学水解聚合物能耗高、材料消耗大；另一方面，尼龙酶底物范围窄，NylB 无法代谢 PA6.6 低聚物，NylC 对大环状低聚物无活性。未来研究可聚焦于优化化学预处理，降低能耗和材料使用，开发更高效尼龙酶，拓展底物范围，进一步工程改造 P. putida，提高产品产量。

尽管存在挑战，但该研究为塑料回收开辟了新方向。随着研究深入，有望实现 PA 废料的高效回收利用，推动塑料行业向可持续发展转型，对解决全球塑料污染问题具有重要意义。