疾病相关变异的功能分析阐明NLRP3激活和抑制的机制

编码NLRP3基因的功能获得变异导致构成炎性小体激活和过量的IL-1β产生。在这个资源中，作者进行了临床相关NLRP3变异的功能筛选。结构分析表明，变体激活NLRP3的多种机制和致病变体的鉴定可以使NLRP3在尼日利亚菌素和低温暴露下的激活变得敏感。

　　

NLRP3 炎症小体相关研究新进展：助力 CAPS 精准诊疗与机制解析

近日，来自 Centre for Innate Immunity and Infectious Diseases, Hudson Institute of Medical Research 等多个单位的研究人员在《Nature Immunology》期刊上发表了题为 “Mechanisms of NLRP3 activation and inhibition elucidated by functional analysis of disease-associated variants” 的论文。该研究通过对疾病相关变异的功能分析，深入探究了 NLRP3 炎症小体的激活和抑制机制，为 cryopyrin 相关周期性综合征（CAPS）的诊断、治疗以及 NLRP3 炎症小体的机制研究提供了重要依据，在自身免疫性疾病研究领域具有重要意义。

研究背景

NLRP3 炎症小体是一种多蛋白复合物，在先天免疫信号传导中发挥着关键作用。它由 N 端的 pyrin 结构域（PYD）、中央的 NACHT 结构域和 C 端的富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域组成 。NLRP3 的激活需要两个步骤，即启动和激活。启动过程通常涉及 Toll 样受体下游的核因子（NF）-κB 信号传导，导致 NLRP3 和前炎性细胞因子 pro-IL-1β 的蛋白合成增加以及 NLRP3 的翻译后修饰；激活过程则可由多种触发因素引发，如细菌毒素尼日利亚菌素、危险相关分子模式（如 ATP）和尿酸结晶等颗粒物，许多激活剂会诱导 K?外流，进而激活 NLRP3。激活后的 NLRP3 炎症小体可促使 caspase-1 激活，切割 pro-IL-1β 和 pro-IL-18，引发炎症反应，在自身炎症性疾病中起关键作用。

CAPS 是一种由 NLRP3 功能获得性变异导致的自身炎症性疾病，根据严重程度可分为家族性寒冷自身炎症综合征（FCAS）、穆克 - 韦尔斯综合征（MWS）和新生儿多系统炎症性疾病（NOMID）。目前，针对 CAPS 已有多种抗 IL-1 治疗方法，但早期诊断和治疗对改善患者生活质量、避免器官损伤至关重要。然而，NLRP3 基因变异的致病性分类存在困难，国际自身炎症性疾病变异登记库 INFEVERS 中 83% 的变异以及 ClinVar 数据库中大多数变异缺乏功能分析数据。此外，不同 NLRP3 变异对小分子抑制剂 MCC950 的反应存在差异，因此全面了解 NLRP3 变异的功能及对抑制剂的反应，对 CAPS 的精准诊疗意义重大。

研究材料与方法

研究材料

研究人员从 INFEVERS 登记库、ClinVar 数据库以及个人联系获取了 534 个 NLRP3 变异体。使用的细胞系包括人胚肾 293T 细胞、人髓样细胞系 THP-1 细胞和 U937 细胞等，并通过多种质粒转染、病毒感染等方式构建稳定细胞系。同时，使用了多种抗体用于免疫印迹检测，以及 ELISA 试剂盒用于细胞因子浓度测定。

关键技术路线

1. 构建稳定细胞系：通过逆转录病毒转导构建稳定表达 BFP 标记的 ASC 的 HEK293T 细胞系；利用 lentiCRISPR v2 质粒和 guide RNAs 构建 NLRP3 或 NEK7 基因敲除细胞系；通过慢病毒包装将携带 NLRP3 变异体的质粒转染到 THP-1 细胞中，使其稳定表达 NLRP3 变异体。

2. 功能检测实验：利用基于图像的流式细胞术检测 ASC 斑点形成，以评估 NLRP3 变异体的活性；通过转染和刺激细胞，检测不同条件下 NLRP3 变异体的活性变化，如用尼日利亚菌素诱导 K?外流、低温刺激、MCC950 抑制等；使用 ELISA 测定细胞培养上清液中 IL-1β、IL-18 等细胞因子的浓度，评估炎症反应强度。

3. 数据分析方法：运用 R 语言程序对不同 NLRP3 表达水平下的 ASC 斑点百分比进行自动分析，计算形成 50% ASC 斑点所需的 NLRP3 量（EC??），并与野生型（WT）比较得出 EC??比值，进而定义 ASC??值来评估 NLRP3 变异体的活性；利用生物信息学工具（如 DynaMut、mCSM - lig、Jpred 等）预测蛋白质结构稳定性、配体亲和力和二级结构；通过结构分析软件（如 ChimeraX、Pymol）研究 NLRP3 变异体的结构变化。

研究结果

1. NLRP3 活性的功能测试揭示致病性 CAPS 变异

研究人员开发了一种自动化功能测试方法，对 534 个 NLRP3 变异体进行筛选。通过分析 ASC 斑点形成，计算出每个变异体的 ASC??值，发现导致 NLRP3 活性增强的变异主要集中在 NACHT 结构域的 NBD 和 HD2 亚结构域，PYD 和 LRR 结构域也有少量高活性变异。NOMID 变异体的 NLRP3 激活水平最强，MWS 和 FCAS 变异体的激活水平相对较低。同时，通过对不同遗传状态（种系、镶嵌或两者皆有）的致病性和可能致病性变异的分析，发现仅为镶嵌状态的变异比种系变异更活跃。此外，研究还重新评估了部分 NLRP3 变异体的致病性分类，将 19 个来自 INFEVERS 登记库和 20 个来自 ClinVar 数据库的意义不明变异（VUS）重新分类为可能致病性变异，同时将部分致病性或可能致病性变异重新分类为可能良性或 VUS，如对携带 R605G 变异的患者进行随访，结合功能检测结果将其变异重新分类为可能良性。

2. 筛选中鉴定出功能缺失的 NLRP3 变异

在 HEK293T 细胞筛选过程中，研究人员发现了一些 ASC 值远低于 WT 的 NLRP3 变异体，如 R7C、R7H、D31V 等，这些变异体主要位于 PYD 结构域，完全丧失了形成 ASC 斑点的能力，且除 M70T 外，对尼日利亚菌素刺激均无反应。此外，Q225P 和 R556 * 在 THP-1 细胞中虽能在 HEK293T 细胞中形成 ASC 斑点，但无炎症小体活性。这些功能缺失变异体在大型数据库（如 gnomAD）中未以纯合子形式出现，其对健康的影响尚不清楚。

3. 致病性 NLRP3 变异导致结构破坏从而增强活性

研究人员对影响 NLRP3 激活过程中结构重排的变异体进行研究。发现位于 NLRP3 结构重排关键位点的变异均导致 NLRP3 活性增加，如 F304C 变异可能通过形成二硫键锁定 NLRP3 的活性结构，促进其活性。位于 Walker B 基序的多个变异（如 G303D、F304L/C、D305N/G/H/A、E306K/D）以及 ATP 结合口袋附近的变异（如 L413F、W416L）均影响 ATP 结合或水解，从而促进 NLRP3 活性。此外，位于活性 NLRP3 寡聚体界面（如 W416L、F445L、A441P、K437N）的变异可能促进活性寡聚体形成，而位于非活性 NLRP3 寡聚体结构界面（如 E690K、E692K）的变异则可能破坏非活性复合物的稳定性。在 PYD 结构域的 H51R 和 D21H 变异可促进 PYD - PYD 相互作用，进而增强 NLRP3 活性。

4. 对刺激超敏感的 NLRP3 变异

部分 CAPS 相关的 NLRP3 VUS 在基础状态下与 WT 的 ASC 值相似或仅略有增加，但可能对 NLRP3 激活触发因素超敏感。研究人员用尼日利亚菌素刺激 NLRP3 变异体，发现 Y861H 和 R920Q 等变异体对尼日利亚菌素的反应活性增加，且这些对 K?外流敏感的变异体大多位于 NLRP3 表面。进一步研究表明，增加培养基中 KCl 浓度可抑制尼日利亚菌素诱导的激活，但不抑制基础或自激活的 NLRP3 变异体活性。通过结构分析和实验验证，发现这些变异体与 NEK7 紧密接触，但 NEK7 对部分尼日利亚菌素敏感的 NLRP3 变异体的超活性并无贡献。此外，研究还发现这些变异体可影响 LRR - LRR 界面，破坏非活性 NLRP3 复合物的形成，从而使 NLRP3 对尼日利亚菌素更敏感。

5. 冷暴露触发变异特异性 NLRP3 过度激活

研究人员对部分 NLRP3 变异体进行低温刺激实验，发现 L355P 和 D305N 等变异体在低温暴露后 NLRP3 活性增加，其他如 E629G、C261W 等 INFEVERS 变异体以及 V643M、F257fs 等 ClinVar 变异体在低温下也表现出 NLRP3 活性增强。这些冷敏感变异体大多位于 NACHT 结构域。通过对同一位置不同变异体的研究发现，特定位置的变异并不决定温度敏感性，氨基酸变化的精确性质才是影响 NLRP3 对低温反应的关键因素。以 L413V 变异体为例，其位于 ATP 结合口袋的疏水区域，通过 DynaMut 预测发现该变异体具有较高的振动能量，使活性状态下的 NLRP3 结构不稳定，在低温环境下其对 NLRP3 活性的影响更易显现。

6. 翻译后修饰对 NLRP3 活性的影响

研究人员将位于 NLRP3 翻译后修饰位点（如 S198、K567 和 Y861）的变异体（S198N、K567E、Y861H 和 Y861C）重构到 NLRP3 缺陷的 THP-1 细胞中进行研究。发现磷酸化抗性的 S198N 变异体在对尼日利亚菌素的反应中产生较少的 IL-1β 和 IL-18，而 K567E 变异体在 HEK293T 细胞和 THP-1 细胞中均表现出活性增加，这与小鼠 NLRP3 在 K565 位点泛素化促进活性的研究结果不同（该结果未在人 NLRP3 中得到证实）。此外，Y861C 变异体因不能被磷酸化而具有增加的炎症小体活性，Y861H 变异体在无炎症小体触发因素时与 WT 相似，这些结果与已发表的观察结果一致，即该特定变异可驱动非典型激活信号依赖性 CAPS 表型。

7. 特定 NLRP3 变异对 MCC950 耐药

研究人员发现，大多数 NLRP3 变异体在 MCC950 处理后活性降低，但 L355P、T438P、E527V 等多个变异体对 MCC950 介导的抑制不敏感。延长 MCC950 处理时间至 12 小时后，部分变异体（如 L355P）的活性受到抑制，但仍有部分变异体（如 T438P、E527V 等）持续耐药。这些耐药变异体包括 MCC950 结合位点附近螺旋中脯氨酸的改变以及 PYD 结构域的变异，生物信息学分析表明这些变异体与 MCC950 的结合亲和力降低。在 THP-1 细胞中的实验结果与 HEK293T 细胞一致，提示在对 CAPS 患者进行分层以开展未来临床试验时，需考虑这些对 MCC950 不敏感的变异体。

研究结论与讨论

本研究通过对大量 NLRP3 变异体的功能分析，建立了一种基于 ASC??值的 NLRP3 变异体活性评估模型，为 NLRP3 变异的致病性分类提供了有力依据，有助于 CAPS 的临床诊断。研究还揭示了 NLRP3 激活和抑制的多种机制，包括变异对 NLRP3 结构、ATP 结合、寡聚化、与 NEK7 相互作用以及对翻译后修饰的影响等，为深入理解 NLRP3 炎症小体的激活机制提供了重要信息。此外，研究明确了不同 NLRP3 变异体对 MCC950 的敏感性差异，为未来针对 NLRP3 的靶向治疗提供了参考，有助于避免在临床试验中纳入对 MCC950 反应不佳的患者，并推动开发具有不同结合位点的新型抑制剂。

然而，该研究也存在一定的局限性。例如，研究中对 NLRP3 激活的定义可能会遗漏一些改变 NLRP3 表达水平的变异；NLRP3 感知 K?外流的机制仍难以与研究结果完全整合；虽然明确了部分冷敏感变异体的机制，但对于 NLRP3 变异体温度敏感性的潜在机制仍需进一步研究。尽管如此，该研究在 CAPS 的诊断、NLRP3 炎症小体机制解析以及靶向治疗等方面取得的重要进展，为未来自身免疫性疾病的研究和治疗奠定了坚实基础，具有极高的科学价值和临床应用潜力。