TaDRIM-seq技术：探索染色质相关RNA与RNA相互作用的有力工具

　　

近日，华中农业大学国家作物遗传改良重点实验室等多单位合作的研究成果《Simultaneous profiling of chromatin-associated RNA at targeted DNA loci and RNA-RNA Interactions through TaDRIM - seq》发表于Nature Communications期刊上。

这一研究成果意义重大，为深入探究染色质相关 RNA（caRNA）在基因调控和基因组结构中的作用提供了全新视角与有力技术支持，有助于揭示真核生物基因组转录调控的复杂机制，对动植物生物学基础研究以及相关应用领域的发展有着重要推动作用。

一、研究背景

真核生物基因组可转录生成多种 RNA，其中部分 RNA 能与染色质在转录位点顺式或与其他基因组位点反式结合，这些 caRNA 在基因转录、表观基因组修饰和染色质状态调控等方面发挥关键作用。在哺乳动物中，约 1500 种 RNA 结合蛋白与不同调控 RNA 相互作用以执行功能。同时，RNA-RNA 空间相互作用及其结合蛋白在基因转录激活时促进染色质环化，表明 RNA 分子在三维基因组结构中的功能多样性是通过与蛋白质、DNA 和 RNA 的网络互作实现的。

然而，目前研究 caRNA 的方法存在诸多局限。ChRD-PET 和 RedChIP 等技术需要大量研究资源，实验流程繁琐耗时，体外连接反应效率低，且无法捕获 RNA-RNA 相互作用。因此，开发一种高效、能同时检测 RNA-染色质和 RNA-RNA 相互作用的技术迫在眉睫。

二、研究材料与方法

（一）研究材料

研究选用人类 K562 和 293T 细胞、水稻以及拟南芥作为实验材料。K562 和 293T 细胞分别在 RPMI 1640 和 DMEM 培养基中培养，添加 10% FBS 和 1% 青链霉素，于 37°C、5%  培养箱中生长。水稻种子播种后在正常农业条件或温室中生长，拟南芥种子经表面消毒和分层处理后在 MS 平板上培养。

（二）技术方法

研究人员报告了一种名为 TaDRIM-seq 的技术，它结合了 PG-Tn5 靶向 DNA 元件和原位邻近连接，可同时绘制RNA-染色质相互作用图谱和RNA空间相互作用图谱。为评估 TaDRIM-seq 技术性能，研究人员进行系列对照实验。用 H3K4me3 抗体在 K562 细胞中测试不同交联条件对该技术的影响；在 K562、293T 细胞以及水稻、拟南芥中应用该技术，检测其稳健性和重复性；将 TaDRIM-seq 与 CUT&Tag 对比评估 DNA 检测特异性，通过分析 RNA 链特异性评估 RNA 捕获特异性，并与 RedChIP、fRIP-seq 等方法比较检测 RNA-DNA 相互作用的一致性。

三、研究结果

TaDRIM-seq 技术概述

首先用 1% 甲醛交联细胞或植物组织，分离细胞核后与特异性抗体孵育，PG-Tn5 与抗体结合，通过转座作用标记靶向基因组 DNA。设计 5’端腺苷酸化生物素标记的桥接接头，特异性连接 3’端 RNA 和双链 DNA。接着进行原位 RNA 连接、cDNA 合成，通过原位邻近连接生成嵌合片段。之后将连接产物转化为双链 DNA，利用亲和捕获和 PCR 扩增构建 TaDRIM-seq 文库用于测序。测序数据通过两种不同流程分析，获取靶蛋白特异性 RNA-DNA 相互作用组和核内全局 RNA-RNA 相互作用信息。

通过优化交联条件，确定 1% 甲醛交联 10min 时 TaDRIM - seq 在 K562 细胞中信号噪比最佳。在多种细胞和植物样本中，这种技术展现出高稳健性和重复性。与 CUT&Tag 对比，TaDRIM-seq 在检测 DNA 位点时特异性较高，能成功捕获目标蛋白靶向的 DNA 区域，反映人类细胞和植物中 RNA 的特异性，且与其他方法检测的 RNA-DNA 相互作用结果高度一致。

利用 TaDRIM-seq 分析表观基因组、RNA-DNA 和 RNA-RNA 相互作用组

构建 RNA-DNA 热图发现，caRNA 与 H3K4me3 标记的基因组区域存在广泛相互作用，且能原位分析 H3K4me3 标记区域的转录本及其结合位点。在 H3K4me3 TaDRIM-seq 数据中，鉴定出大量可定位的读数，生成众多分子内和分子间 RNA-RNA 相互作用簇，表明不同 RNA 分子在核内存在广泛相互作用，如 MALAT1 和 NEAT1 不仅在染色质上显著富集，还形成相互作用。这些结果表明 TaDRIM-seq 是一种有效的多组学技术。

TaDRIM-seq 与现有技术的比较

与 RedChIP、ChRD-PET 等类似技术相比，TaDRIM-seq 优势明显。它能够在同一实验中同时检测 RNA-染色质和 RNA-RNA 相互作用；无需免疫沉淀、末端修复、加A尾和超声处理，降低技术复杂性和操作时间。TaDRIM-seq 使实验中的植物材料和起始细胞分别减少了17倍和20倍，并与长读长测序兼容。TaDRIM-seq 在检测 RNA-染色质相互作用时分辨率更高，尤其在植物系统中表现突出。这些结果表明，与现有方法相比，TaDRIM-seq 在实验复杂性、起始细胞量和分辨率等方面都有显著改进，同时还提供了 RNA-RNA 相互作用数据。

RNA-DNA/RNA-RNA 相互作用的全局视图及其与三维基因组结构的关系

分析水稻和 K562 细胞中单个 RNA 介导的相互作用发现，一些 RNA 在特定染色质靶点的相互作用连接频率高，如 MALAT1 在不同区域的相互作用存在差异。部分剪接体相关 snRNA 在活性染色质区域介导更多相互作用，反映其在 RNA 加工机制中的作用。将 CTCF TaDRIM-seq 数据与 CTCF 相关 ChIA-PET 数据结合，发现锚定基因的 H3K4me3 和 RNAPII 强度更高，且许多 RNA-DNA 相互作用与染色质环的锚定区域相关，表明 RNA 广泛存在于染色质环的锚定区域，某些 RNA 可能通过 RNA-RNA 相互作用间接靶向特定基因组位点。

水稻昼夜周期中 RNA-DNA 相互作用的动态变化

对上午 8 点和晚上 8 点采集的水稻样本进行 H3K9ac TaDRIM-seq 分析，发现不同分辨率下 RNA-染色质接触矩阵存在差异，晚上 8 点时一些 RNA 与基因组区域的相互作用更强。不同类型 RNA 的相互作用模式在昼夜存在变化，snRNA 和 snoRNA 主要参与染色体间相互作用，而 mRNA、lncRNA 和 microRNA 在晚上染色体内相互作用增加。通过比较不同时间点 RNA 的相互作用连接频率，鉴定出时间特异性 caRNA，GO 富集分析显示不同时间点与特定 RNA 相互作用的 DNA 在不同生物学过程中富集，表明 TaDRIM-seq 可区分时间特异性 RNA-染色质相互作用，为研究昼夜节律基因协调提供新视角。

结合 Hi-C 数据发现，H3K9ac 介导的染色质相互作用在昼夜存在差异，时间特异性 caRNA 与染色质环广泛相关。构建相互作用网络发现，早上以 OsLHY 为中心的 RNA-DNA 网络连接紧密，晚上则较为分散，表明 RNA-染色质、RNA-RNA 和 DNA-DNA 相互作用的变化在昼夜周期中形成不同网络，有助于理解植物 caRNA 在染色质结构和基因调控中的潜在作用。

四、研究结论与讨论

这项研究开发的 TaDRIM-seq 技术能同时捕获不同表观基因组或蛋白质靶向区域的 RNA-DNA 相互作用以及全局 RNA-RNA 相互作用组。它在动植物系统中展现出诸多优势，比如简化实验流程、减少样本需求、提高分辨率等。

TaDRIM-seq 技术在水稻研究的应用揭示了活性和非活性染色质区域中 caRNA 的全基因组相互作用，发现不同类型 RNA 在染色质相互作用中的偏好差异，以及一些 lncRNA 在基因组中的广泛分布和相互作用模式。同时，通过检测水稻昼夜周期中 RNA-染色质和 RNA-RNA 相互作用的变化，揭示了动态 RNA-染色质相互作用在节律性生物过程中的潜在功能。

总体而言，TaDRIM-seq 技术为研究 RNA-染色质和 RNA-RNA 相互作用提供了丰富的资源，是研究 caRNA 在染色质重塑和基因调控中作用的有效工具，有望推动动植物的基因调控机制研究取得新突破。