经皮微针辅助超声增强CRISPRa系统，实现超声基因治疗肥胖

肥胖是一项日益严峻的全球健康挑战，需要有效和创新的治疗模式。在这里，作者展示了一种装载金属有机框架（mof）和crispr - ucp1系统的微针给药平台，用于肥胖的超声基因治疗。

　　

时空可控超声基因治疗平台：对抗肥胖的新策略

同济大学附属上海市第十人民医院的 Shaoyue Li 等研究人员在Nature Communications杂志上发表了题为 “Transdermal microneedle-assisted ultrasound-enhanced CRISPRa system to enable sono-gene therapy for obesity” 的论文。该研究开发出一种时空可控的微针药物递送平台用于声基因治疗肥胖症，为肥胖及其他代谢性疾病的治疗提供了新的思路和潜在的治疗范式，在医学领域具有重要意义。

一、研究背景

肥胖已成为全球日益严峻的健康问题，其发病率不断攀升，且与心血管疾病、2 型糖尿病、骨关节炎、脂肪肝及多种癌症等并发症密切相关，是全球第二大可预防的死亡原因。肥胖的主要特征是脂肪组织中脂肪过度积累，脂肪组织分为白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT），前者主要用于储存脂质，后者则通过消耗脂质和葡萄糖产热。

白色脂肪细胞因其位置表浅且易于触及，被视为对抗肥胖的主要治疗靶点。棕色脂肪细胞含有多个线粒体，表达独特的产热基因，其中解偶联蛋白 1（UCP1）发挥核心作用，它能使氧化磷酸化与三磷酸腺苷（ATP）生成解偶联，将能量以热量形式散发，从而对抗肥胖及相关代谢紊乱。激活 UCP1 表达可招募表达 UCP1 的米色脂肪细胞，促进白色脂肪组织褐变，增加能量代谢和产热。然而，目前调节基因以实现 UCP1 持续过表达的技术存在免疫原性和基因突变等不可忽视的局限性。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关核酸酶蛋白 9（Cas9）系统，包括 CRISPR 激活（CRISPRa）和 CRISPR 干扰（CRISPRi）基因编辑技术，是强大的基因表达调控工具，可高效精准地稳定过表达或敲低靶基因，已在科学界广泛应用。该技术虽已用于激活小鼠白色前脂肪细胞中的 UCP1 基因，但 CRISPR-dCas9 技术在疾病治疗中直接递送体内后，易受到 CRISPR 系统如质粒 DNA（pDNA）和核糖核蛋白（RNP）的降解和免疫清除。此外，常用载体如腺相关病毒（AAV）、慢病毒和非病毒载体脂质纳米颗粒等存在载量有限和全身毒性等问题。

金属 - 有机框架（MOFs）因其大表面积、可定制孔径、生物相容性和可控降解等特性，成为核酸治疗递送的有前景选择。部分 MOF 材料对超声（US）有响应，可产生活性氧（ROS），过量的 ROS 能诱导白色脂肪细胞凋亡，有助于减肥。聚乙二醇（PEG）共价修饰可降低其细胞毒性。基于此，研究人员开发了一种智能时空可控的超声减肥微针（MN）贴片，旨在通过上调减肥相关基因并杀死多余白色脂肪细胞，实现声基因治疗肥胖症。

二、研究材料和方法

（一）材料

研究中使用的化学试剂大多购自 Sigma-Aldrich，部分特殊试剂如四（4 - 羧基苯基）卟啉（TCPP）、吡嗪等购自其他公司。实验所用细胞系 3T3-L1 胚胎成纤维细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），实验动物为雄性 C57BL/6 J 小鼠。

（二）方法

1. 纳米系统的制备与表征：通过多种实验技术对 MOF（Zn-TCPP）和 MP/aUCP1 纳米片进行表征，包括透射电子显微镜（TEM）观察形态和尺寸、X 射线光电子能谱（XPS）分析元素组成和价态、紫外 - 可见光谱（UV-vis）检测光学性质、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）研究分子结合模式等。

2. 细胞实验：进行细胞培养、转染、蛋白质印迹、细胞凋亡检测、细胞活力评估、细胞摄取和溶酶体逃逸分析等实验，以研究纳米系统在细胞水平的性能。

3. 动物实验：构建肥胖小鼠模型，将其随机分组进行不同处理，监测体重、食物摄入量等指标。实验结束后，对小鼠进行解剖，收集组织样本进行组织学分析、基因表达检测、蛋白质印迹分析等，评估治疗效果和安全性。

4. 其他实验：制备微针贴片并对其进行表征，包括观察形态、检测机械强度、监测药物分布等。利用代谢生理笼研究小鼠代谢变化，进行冷暴露实验评估耐寒能力，使用抑制剂处理细胞探究相关机制，并进行 RNA 测序分析基因表达谱变化。

（三）关键技术路线

研究人员首先合成了经甲氧基聚乙二醇 - 聚乙烯亚胺（mPEG-PEI）修饰的 Zn-TCPP MOF，并将其作为载体负载 CRISPRa-UCP1 质粒（aUCP1），构建 MP/aUCP1 纳米系统。随后，将该纳米系统封装在透明质酸（HA）微针贴片中，制备出 MN-MP/aUCP1 超声控释减肥平台。该平台利用微针的透皮特性，将声基因调制系统递送至皮下脂肪层并穿透脂肪细胞。在超声的时空控制下，一方面激活 MOF 高效产生活性氧以杀死多余白色脂肪细胞；另一方面通过声动力效应增强 UCP1 表达，并刺激 CRISPRa-UCP1 系统中 UCP1 的激活，促进白色脂肪组织褐变，实现 “歼灭” 和 “对抗” 两大策略。

三、研究结果

（一）MP/aUCP1 纳米系统的制备与表征

通过 TEM 观察到 MOF（Zn-TCPP）呈层状结构，平均直径约 250nm，元素均匀分布。XPS、UV-vis、FT-IR 等表征结果证实了 Zn-TCPP 的成功合成及结构特征。构建的 CRISPRa-UCP1 质粒能有效提高成熟脂肪细胞中 UCP1 的表达。琼脂糖凝胶电泳实验确定 MP 与 aUCP1 的最佳结合质量比为 4:1，TEM 和 zeta 电位分析表明 mPEG-PEI 成功修饰且 aUCP1 成功负载。动态光散射（DLS）和 X 射线衍射（XRD）结果显示，负载 aUCP1 后 MP 的平均尺寸增大，但纳米系统仍保持良好结晶度。

（二）MP/aUCP1 纳米系统的声动力性能和体外抗肥胖性能

UV-vis 和电子自旋共振（ESR）光谱检测表明，MP/aUCP1 纳米系统在超声刺激下能有效产生活性氧（ROS），且随着超声刺激时间延长，单线态氧（）产量显著增加。流式细胞术（FCM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析显示，MP/aUCP1 在完全分化的 3T3-L1 前脂肪细胞中，经超声刺激后能产生大量细胞内 ROS。体外抗肥胖实验表明，MP/aUCP1 具有高生物安全性，对 3T3-L1 前脂肪细胞和成熟脂肪细胞的细胞毒性可忽略不计。在超声照射下，MP/aUCP1 对成熟脂肪细胞和 3T3-L1 前脂肪细胞具有显著的声动力治疗（SDT）效应，能诱导细胞凋亡并有效抑制脂质储存。

（三）MP/aUCP1 纳米系统的体外高效溶酶体逃逸和基因编辑能力

CLSM 观察发现成熟脂肪细胞能有效内化 MP/aUCP1，且超声增强了其细胞内富集。MP/aUCP1 纳米系统在孵育 4 小时后能成功逃避溶酶体，超声照射下该效应更明显。以增强绿色荧光蛋白（pEGFP）为报告基因，FCM 分析显示 MP/aUCP1 在超声照射下转染效率超过 50%，显著高于 P/aUCP1，与 Lipofectamine 2000 相当。

（四）MN-MP/aUCP1 贴片的制备与表征

采用微模塑方法制备的 MN-MP/aUCP1 贴片尺寸为 1 cm×1 cm，包含 12×12 的微针阵列，微针呈金字塔形，基底直径 300μm，高 800μm。扫描电子显微镜（SEM）图像显示负载药物不影响微针合成，15 wt% HA 制备的微针贴片具有良好机械性能，能顺利穿透皮肤且无明显皮肤刺激或损伤。体内成像系统（IVIS）光谱成像显示，MN 贴片能提高 MP/aUCP1 在白色脂肪组织（WAT）中的长期保留。

（五）MN-MP/aUCP1 + US 的抗肥胖效果

对饮食诱导肥胖的 C57BL/6 J 雄性小鼠进行不同处理，结果显示 MN-MP/aUCP1 + US 组和 MN-MP + US 组小鼠体重显著下降，分别减轻 18.3% ± 1.7% 和 13.4% ± 3.2%，且身体脂肪减少，体型更瘦。H&E 染色表明该处理不仅显著缩小腹股沟白色脂肪组织（IgWAT）中的脂肪细胞，还能减少性腺周围白色脂肪组织（PgWAT）和肾周白色脂肪组织（PrWAT）中的脂肪细胞，同时改善肝脏脂肪含量和形态。

（六）MN-MP/aUCP1 + US 治疗后体重反弹的监测

在治疗后的 15 天监测期内，MN-MP/aUCP1 + US 组小鼠体重增加最少，表明该治疗策略能有效抑制体重反弹。

（七）MN-MP/aUCP1 + US 治疗促进 HFD 诱导肥胖小鼠的产热和代谢

代谢生理笼研究表明，MN-MP/aUCP1 + US 治疗组小鼠在黑暗周期中耗氧量增加，产热升高，且耐寒能力增强，胰岛素抵抗和葡萄糖耐量显著改善，循环葡萄糖和胰岛素水平降低。急性治疗实验排除了体重和脂肪减少对代谢改善的影响，表明该治疗可通过激活 IgWAT 产热和提高代谢水平改善肥胖和相关代谢紊乱。

（八）MN-MP/aUCP1 + US 治疗后 IgWAT 分子水平的变化

TUNEL 检测显示 MN-MP/aUCP1 + US 治疗组小鼠 IgWAT、PgWAT 和 PrWAT 中的凋亡细胞显著增加，同时脂肪组织中 ROS、脂质过氧化产物和 DNA 氧化产物水平升高，表明存在氧化应激。免疫荧光和蛋白质印迹分析表明，治疗后 UCP1 表达增加，同时 PGC1-β 表达增加，PPARγ 表达减少，脂肪组织 TG 含量降低，FFA 水平升高，且未发生基因突变。

（九）MN-MP/aUCP1 + US 减肥能力的机制探索

转录组测序分析发现，MN-MP/aUCP1 + US 治疗后，IgWAT 中共有 5791 个差异表达基因（DEGs），GO 分析显示这些基因显著富集在脂质代谢、脂肪酸代谢、棕色脂肪细胞分化和脂肪酸 β - 氧化等生物学过程，以及线粒体、过氧化物酶体等细胞成分相关功能。GSEA 分析证实该治疗有效增强 ROS 产生并诱导脂肪细胞凋亡，同时上调与葡萄糖或脂肪酸代谢、线粒体功能相关基因，抑制脂肪生成和分化相关基因。

四、研究结论与讨论

本研究开发了一种时空可控的超声诱导基因调控策略治疗肥胖症，该策略结合声动力疗法（SDT）和基因组编辑疗法，具有独特优势。与现有光动力和光热疗法相比，SDT 穿透能力更强，能精准作用于皮下脂肪层，减少内脏脂肪，缓解脂肪负担引起的内脏疾病，为肥胖患者提供了更具针对性的减肥方法。SDT 可刺激产热相关基因表达，促进 MP/aUCP1 系统从微针贴片中释放，协同促进白色脂肪细胞褐变，增强小鼠的产热和代谢能力，同时诱导 ROS 产生，促进多余白色脂肪细胞凋亡，且升高的 ROS 水平有助于 UCP1 依赖的产热过程，从而有效对抗肥胖。

该研究深入揭示了声基因治疗平台的作用机制，代谢笼研究和血清指标分析表明，声基因治疗介导的脂肪组织转录组变化可影响全身代谢，减少脂肪生成和分化，避免脂肪萎缩相关风险，显著改善胰岛素抵抗。此外，ROS 引起的氧化应激并未导致全身炎症，可能得益于透明质酸的抗炎特性。

在临床应用方面，该研究为肥胖及其他代谢性疾病的治疗提供了极具潜力的新方法，有望通过时空可控的声基因治疗平台实现更好的临床治疗效果。然而，目前研究主要在小鼠模型上进行，未来还需进一步开展临床试验，验证该治疗策略在人体中的安全性和有效性，推动其从基础研究向临床应用的转化，为解决全球肥胖问题提供切实可行的方案。