KMT5C调节肝脏糖异生的非催化机制

糖异生从非碳水化合物碳底物中产生葡萄糖，特别是在禁食期间发生。在这里，作者发现赖氨酸甲基转移酶KMT5C通过降低PGC-1α的降解来促进糖异生，这与甲基转移酶的活性无关。

　　

赖氨酸甲基转移酶 KMT5C 调控肝脏糖异生的非催化机制研究解读

复旦大学基础医学院生物化学与分子生物学系等单位的研究人员在Nature Communications期刊上发表了题为 “Non-catalytic mechanisms of KMT5C regulating hepatic gluconeogenesis” 的论文。该研究首次揭示了赖氨酸甲基转移酶 KMT5C 在肝脏糖异生调控中的关键作用及非催化机制，为深入理解肝脏代谢调控网络提供了新视角，也为 2 型糖尿病的治疗提供了潜在的新靶点和理论依据，在代谢性疾病研究领域具有重要意义。

一、研究背景

肝脏在维持血糖稳态中扮演核心角色，在饥饿状态下，其通过糖原分解和糖异生途径产生葡萄糖。其中，糖异生在长时间禁食时对维持血糖水平尤为关键。2 型糖尿病（T2DM）作为一种常见的代谢性疾病，其特征为高血糖和胰岛素抵抗。在 T2DM 病理状态下，肝脏糖原含量和糖原分解降低，而糖异生异常增强，导致空腹和餐后高血糖加剧。因此，探究糖异生的调控机制及其在糖尿病中的作用至关重要。

胰高血糖素是激活肝脏糖异生的重要激素，其通过依赖 PKA 的信号通路磷酸化 CREB，增强 CREB 转录活性，使其与共激活因子或组蛋白修饰酶结合，营造利于转录的染色质环境，促进糖异生基因转录。PGC-1α 作为 CREB-CRTC2 下游的关键转录共激活因子，可激活肝细胞核因子 - 4α（HNF4α）和叉头框 O（FOXO）1，进而促进关键糖异生酶的基因转录。此外，PGC-1α 的乙酰化和磷酸化修饰在葡萄糖稳态调控中也发挥重要作用，且其蛋白稳定性的调节是控制肝脏糖异生的另一关键机制。

KMT5C 作为一种组蛋白 H4 赖氨酸 20 甲基转移酶，参与多种生物学过程，如异染色质形成、基因组完整性维持和基因表达调控等，这些功能通常与 H4K20me3 标记相关。然而，此前尚无研究明确 KMT5C 在肝脏代谢中的作用。

二、研究材料和方法

（一）实验动物

选用 C57BL/6 背景的小鼠，包括 Kmt5c floxed 小鼠、Albumin-Cre 小鼠、db/db 小鼠、ob/ob 小鼠等。动物实验遵循复旦大学上海医学院动物伦理委员会批准的程序进行。小鼠饲养于 12 小时光照、12 小时黑暗的环境，自由摄食普通饲料或高脂饲料。

（二）细胞系

使用人肝癌细胞系 HepG2、人胚肾细胞系 HEK293T 和小鼠原代肝细胞。细胞培养于含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素的 DMEM 培养基中，在 37°C、5% CO?的湿润环境中培养，并定期检测支原体污染情况。

（三）主要实验技术

1. 基因操作技术：通过慢病毒介导的短发夹 RNA（shRNA）转导敲低 Kmt5c 基因表达；利用腺相关病毒（AAV）和腺病毒实现基因的过表达或敲除；构建质粒用于转染细胞，以研究基因间相互作用。

2. 蛋白检测技术：采用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析检测蛋白表达水平；运用免疫沉淀（IP）技术研究蛋白质 - 蛋白质相互作用；通过微尺度热泳（MST）测定蛋白质结合亲和力；利用泛素化检测实验分析蛋白质的泛素化水平。

3. 分子生物学技术：提取 RNA 并进行逆转录和定量 PCR（qPCR），检测基因转录水平；运用染色质免疫沉淀（ChIP）实验探究蛋白质与 DNA 的相互作用。

4. 动物实验检测指标：测定小鼠血糖、胰岛素、胰高血糖素、皮质酮等激素水平；进行葡萄糖耐量试验（GTT）、丙酮酸耐量试验（PTT）、甘油耐受试验（GlTT）、胰高血糖素耐受试验（GcTT）和胰岛素耐量试验（ITT）评估小鼠糖代谢能力；通过组织学染色观察肝脏细胞形态和结构。

三、研究技术路线

研究人员首先检测 KMT5C 在肝脏中的表达模式，观察其在禁食、再喂养及不同小鼠模型中的变化。接着，通过细胞和动物实验，分别敲低或敲除 KMT5C，探究其对糖异生相关基因表达和葡萄糖生成能力的影响。之后，构建 KMT5C 甲基转移酶活性缺失突变体，研究其对糖异生的调控作用，明确 KMT5C 调控糖异生是否依赖其甲基转移酶活性。

为进一步探究 KMT5C 调控糖异生的分子机制，研究人员检测相关转录因子和共激活因子的表达变化，重点研究 KMT5C 与 PGC-1α 的相互作用及其对 PGC-1α 稳定性的影响。同时，探究 KMT5C 与 E3 泛素连接酶 RNF34 之间的关系，明确其竞争结合 PGC-1α 对糖异生的调控机制。

最后，在糖尿病小鼠模型和人类受试者中，研究敲低 KMT5C 对血糖水平和糖异生的影响，评估其作为治疗靶点的潜力，并探究 KMT5C 表达的调控机制。

四、研究结果

（一）KMT5C 缺失降低肝细胞糖异生基因表达

研究人员发现，禁食 16 小时可使肝脏 KMT5C 水平升高，再喂养后恢复至基础水平。在 ob/ob、db/db 和高脂饮食喂养的小鼠肝脏中，KMT5C 水平显著增加，且 H4K20me3 水平与 KMT5C 水平变化一致。在细胞实验中，通过慢病毒介导的 shRNA 敲低 HepG2 细胞中 Kmt5c 表达，结果显示糖异生关键酶基因 Pck1、Pck1 和 G6pc 的 mRNA 水平显著降低，而糖原代谢、糖酵解、脂肪酸 β - 氧化和脂肪生成相关基因表达无明显变化。在原代肝细胞中，利用 Cre 重组酶腺病毒感染 Kmt5cflox/flox 肝细胞或分离野生型和肝脏特异性 Kmt5c 敲除小鼠的肝细胞，也得到了类似结果。体外葡萄糖生成实验表明，Kmt5c 敲除的肝细胞利用乳酸、丙酮酸或甘油生成葡萄糖的能力受损。

（二）肝脏特异性 KMT5C 敲除小鼠体内糖异生受损

构建肝脏特异性 Kmt5c 敲除小鼠模型，定量 PCR 结果显示，Alb 启动子驱动的 Cre 重组酶特异性降低了肝脏 Kmt5c 表达和 H4K20me3 水平。敲除小鼠与野生型小鼠在体重增长、食物摄入量、肝脏重量和组织学结构上无显著差异。禁食 24 小时诱导糖异生后，敲除小鼠空腹血糖水平显著低于野生型小鼠，但随机血糖水平无差异。同时，敲除小鼠肝脏中糖异生基因的蛋白质和 mRNA 水平降低，而其他糖脂代谢基因表达和甘油三酯含量未受影响。在丙酮酸耐量试验、甘油耐受试验和胰高血糖素耐受试验中，敲除小鼠产生的葡萄糖均少于野生型小鼠。此外，肝脏 KMT5C 缺失不影响血清胰岛素、胰高血糖素和皮质酮水平，也不影响全身胰岛素敏感性。

（三）KMT5C 刺激糖异生不依赖其甲基转移酶活性

在原代肝细胞中过表达 Kmt5c，可提高 PCK1 和 G6PC 蛋白水平。构建 KMT5C 甲基转移酶活性缺失突变体 KMT5C G140Y/W174A（Mut），发现其仍能刺激原代肝细胞中糖异生基因表达和葡萄糖输出，效果与野生型 KMT5C 相似。使用 KMT5C 抑制剂 A-196 处理原代肝细胞，H4K20me3 水平呈剂量依赖性降低，但 PCK1、G6PC 和 PC 水平不受影响。

在体内实验中，通过尾静脉注射表达 KMT5C 或 KMT5C Mut 的 AAV8 病毒，结果显示，成年小鼠肝脏中 KMT5C 的瞬时过表达可显著增加肝脏 H4K20me3 水平，但不影响小鼠体重、肝脏质量和组织学结构。虽然在进食状态下，过表达 KMT5C 不改变肝脏糖异生基因或其他主要代谢基因的表达，但在禁食状态下，其可提高空腹血糖水平，增强糖异生能力。且这些作用均与 KMT5C 甲基转移酶活性无关，因为 KMT5C Mut 在体内同样能有效刺激糖异生和相关基因表达。ChIP 实验结果表明，KMT5C 在调控肝脏糖异生过程中，其甲基转移酶活性并非必需。

（四）KMT5C 通过减少 PGC-1α 泛素化延长其半衰期

检测 KMT5C 敲除和过表达肝脏或肝细胞中转录因子和共激活因子的蛋白水平，发现 PGC-1α 在 KMT5C 缺失时显著下调，而过表达 KMT5C 则使其水平升高。在敲除肝细胞中过表达 Pgc-1α，可恢复 PCK1 和 G6PC 的表达；在敲除小鼠肝脏中通过 AAV 介导表达 Pgc-1α，可修复糖异生缺陷。此外，KMT5C 和 PGC-1α 在原代肝细胞中对 PCK1 和 G6PC 表达具有协同作用，敲低 Pgc-1α 可阻断 KMT5C 对 PCK1 和 G6PC 表达的上调作用。

研究表明，KMT5C 和 KMT5C Mut 均可与 PGC-1α 相互作用，且内源性 KMT5C 与 PGC-1α 存在于同一蛋白复合物中。MST 测定显示，KMT5C 与 PGC-1α 的解离常数（Kd）为 1.733 μM。蛋白酶体抑制剂 MG132 可增加 KMT5C 敲除肝细胞中 PGC-1α 水平，表明泛素 - 蛋白酶体系统参与调控 PGC-1α 水平。KMT5C 和 KMT5C Mut 可显著降低 PGC-1α 的泛素化水平，而 KMT5C 缺失则增加其泛素化，导致 PGC-1α 半衰期缩短。

（五）KMT5C 与 RNF34 竞争结合，延缓 PGC-1α 的泛素化降解

研究人员关注到 RNF34 和 FBXW7 这两种已知的 PGC-1α 的 E3 泛素连接酶。在 HepG2 细胞中，表达 RNF34 或 FBXW7 均可降低 PGC-1α 水平，但 KMT5C 只能对抗 RNF34，逆转 PGC-1α 的减少。免疫沉淀实验表明，KMT5C 和 RNF34 均与 PGC-1α 的 C 末端（氨基酸 565 - 797 片段）相互作用，提示二者存在竞争结合关系。增加 KMT5C 表达可减弱 RNF34 与 PGC-1α 的结合，延长 PGC-1α 半衰期。在原代敲除肝细胞中，敲低 RNF34 表达可恢复 PGC-1α 水平和葡萄糖生成能力；在敲除小鼠中，通过 AAV8-TBG-shRNF34 病毒敲低肝脏 RNF34 水平，可恢复糖异生能力，提高空腹血糖水平，改善丙酮酸和胰高血糖素耐受性。此外，KMT5C 过表达在 RNF34 敲低细胞中不能进一步上调 PGC-1α 和 PCK1 水平，表明二者不存在协同作用。

禁食和胰高血糖素处理可分别增加小鼠肝脏和原代肝细胞中 KMT5C 水平，且更多的 KMT5C 与 PGC-1α 相互作用。免疫沉淀实验发现，KMT5C 特异性地参与 HNF4α 转录机制，而不参与 PPARα 或 FOXO1 复合物，这解释了为何 KMT5C 仅调控糖异生，而不影响脂肪酸 β - 氧化。

（六）靶向 KMT5C 改善糖尿病小鼠糖异生紊乱

在 db/db 糖尿病小鼠肝脏中，糖异生酶和 KMT5C 水平均升高。通过腺病毒注射敲低 db/db 小鼠肝脏 KMT5C 表达，可降低空腹血糖水平，抑制糖异生，下调肝脏糖异生基因和 PGC-1α 水平，且倾向于改善葡萄糖不耐受，而不影响胰岛素耐受性。在野生型和 Kmt5c 敲除小鼠中，高脂饮食喂养 12 周诱导肥胖后，敲除小鼠肝脏葡萄糖输出仍较低，且葡萄糖和胰岛素耐受性得到改善，同时肝脏 G6PC 和 PGC-1α 水平降低。在人类受试者中，肝脏 Kmt5c mRNA 水平与空腹血糖水平呈正相关，2 型糖尿病患者肝脏中 KMT5C 的 mRNA 和蛋白质水平均显著高于非糖尿病对照组。

（七）CREB1 转录调控肝细胞中 Kmt5c 表达

禁食或在糖尿病小鼠模型及人类受试者中，肝脏 KMT5C 表达上调。研究发现，禁食 18 - 24 小时可使肝脏 Kmt5c mRNA 水平增加约 2 倍，表明转录调控在其表达中起重要作用。胰高血糖素刺激可增加原代肝细胞中 KMT5C 蛋白水平。CREB1 作为胰高血糖素激活的主要转录因子，其结合于 Kmt5c 启动子的近端 CRE 位点。在原代肝细胞中过表达或敲低 CREB1，可分别增加或降低 Kmt5c 的 mRNA 和蛋白质水平。在体内实验中，通过水动力转染靶向 Creb1 或 Crtc2 的 shRNAs，可抑制禁食诱导的 Kmt5c 表达；而过表达 Creb1 则可显著提高小鼠肝脏在进食状态下的 Kmt5c 水平。

五、研究结论与讨论

该研究明确了 KMT5C 是肝脏糖异生的重要调节因子。在生理状态下，胰高血糖素通过激活 CREB-CRTC2 轴，促进 Kmt5c 和 Pgc-1α 转录。KMT5C 通过与 E3 泛素连接酶 RNF34 竞争结合 PGC-1α 的 C 末端，减少 PGC-1α 的泛素化和降解，稳定其蛋白水平，进而促进糖异生，以适应机体对葡萄糖的需求。

在 2 型糖尿病等病理状态下，肝脏 KMT5C 水平异常升高，导致糖异生过度激活，加重高血糖症状。敲低或抑制 KMT5C 可有效降低血糖水平，且不影响肝脏脂肪代谢，提示 KMT5C 是改善糖尿病血糖稳态的潜在治疗靶点。

此外，该研究揭示了 KMT5C 促进肝脏糖异生不依赖其甲基转移酶活性的新机制，拓展了对组蛋白修饰酶功能多样性的认识。许多组蛋白修饰酶已被报道具有非催化功能，深入理解这些酶催化与非催化功能的解耦联，将为针对疾病中相关酶功能异常的治疗策略开发提供新思路。

总的来说，该研究为肝脏糖代谢调控机制提供了新见解，为 2 型糖尿病的治疗开辟了潜在的新方向，有望推动相关药物研发和临床治疗的进展。