妊娠期自身抗体暴露影响MAR自闭症大鼠模型的早期大脑发育

　　

妊娠期母体自身抗体暴露对大鼠自闭症模型早期大脑发育影响的研究解读

加利福尼亚大学戴维斯分校（University of California, Davis）的 Janna McLellan、Ana-Maria Iosif 等研究人员在《Molecular Psychiatry》期刊上发表了题为 “Gestational autoantibody exposure impacts early brain development in a rat model of MAR autism” 的论文。该研究通过建立大鼠模型，深入探究妊娠期母体自身抗体（MARA-ABs）暴露对后代早期大脑发育的影响，为揭示自闭症发病机制提供了重要线索，对自闭症的早期诊断和干预具有潜在指导意义。

一、研究背景

自闭症发病率持续上升，从 2010 年的 1/68 增加到 2020 年的 1/36。在自闭症研究领域，妊娠期多种因素，如缺氧缺血事件、感染、接触毒物、母体炎症或自身抗体等，均被证实会对胎儿大脑发育产生影响，增加自闭症发病风险，其中母体自身抗体相关自闭症（MARA）备受关注。

在 MARA 中，母体产生针对胎儿大脑特定蛋白质的自身抗体，这些抗体可通过胎盘进入胎儿体内，与自闭症的发生紧密相关。已识别的相关自身抗体靶蛋白包括乳酸脱氢酶 A/B（LDHA/B）、塌陷反应调节蛋白 1 和 2（CRMP1/2）、鸟嘌呤脱氨酶（GDA）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）以及应激诱导磷蛋白 1（STIP1）等。临床研究发现，不同组合的 MARA 自身抗体（MARA-ABS）与自闭症表型严重程度存在差异，如 LDHA/B + STIP1 + CRMP1 自身抗体组合的母亲，其孩子自闭症表型更严重；CRMP1 + CRMP2 组合不仅与自闭症相关，还与更严重的发育迟缓有关。然而，尽管临床观察到 MARA-ABS 与后代自闭症诊断存在关联，但 MARA-ABS 确切的致病机制尚不明确。

此前，研究团队已开发出内源性驱动的小鼠和大鼠模型，验证了一种 MARA-ABS 模式与病理之间的联系。但不同临床相关 MARA 模式对大脑发育各方面的具体差异影响仍有待进一步研究，这也为本次研究奠定了基础。

二、研究材料与方法

（一）实验动物

选用六周龄的 Sprague-Dawley 大鼠，购自 Charles River Laboratories。大鼠在温度、湿度可控且 12 小时光照 - 黑暗循环的环境中饲养，自由获取食物和水。适应环境两周后，将雌性大鼠随机分为五组，分别为 CRMP1 + CRMP2 组（n = 5）、STIP1 + NSE 组（n = 7）、CRMP1 + GDA 组（n = 6）、LDHA/B + CRMP1 + STIP1 组（n = 5）和佐剂 + 盐水对照组（n = 4）。

（二）肽免疫原制备

研究中使用的肽由 LifeTein LLC 合成，采用 Multiple Antigenic Peptides（MAPs）技术，即基于赖氨酸核心合成四个相同肽表位的拷贝（MAPs - 4 系统），无需载体蛋白即可产生强烈免疫反应。这些肽对应 CRMP1、CRMP2、STIP1、NSE、GDA、LDHA 和 LDHB 等临床相关表位，具体序列见补充表 1。

（三）动物免疫与样本采集

分组后，对每只雌性大鼠进行尾静脉采血获取血清。随后，大鼠每周接受皮下注射，持续五周。注射成分根据分组不同，包括合成肽和弗氏佐剂，对照组仅注射佐剂和盐水。最后一次注射一周后再次采血，通过酶联免疫吸附测定评估抗体反应。确定抗体反应后，将雌性大鼠与雄性大鼠配对饲养一周，之后单独饲养，通过体重变化确认怀孕。在后代出生后第 2 天（PND2），采集大脑和血液样本。根据后代数量，部分雌性大鼠会再次繁殖以获取更多组织样本。用于细胞因子和趋化因子测量的组织样本来自两个窝的后代，用于 RNA 测序的组织样本仅来自第一窝后代。

（四）组织处理与检测

对于 PND2 的大脑样本，加入含 cOmpleteTM 蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液，通过手持超声仪制备全脑裂解物。经过冻融循环、水浴超声处理和离心后，取上清液于 4°C 保存，次日测定总蛋白和细胞因子 / 趋化因子 / 生长因子水平，总蛋白含量使用 bicinchoninic acid assay（BCA）测定。采用 Millipore 27 - plex 磁珠试剂盒检测细胞因子 / 趋化因子 / 生长因子水平，该试剂盒可检测包括白细胞介素（IL）系列、肿瘤坏死因子 - α（TNFα）、干扰素 - γ（IFNγ）等多种因子。血清样本按试剂盒说明操作，大脑样本上清液在遵循其他试剂盒说明的基础上，根据 BCA 测定的总蛋白值进行归一化处理。

（五）RNA 测序与生物信息学分析

收集 71 个 PND2 大鼠大脑用于总 RNA 提取。在 RNA 分离当天，将大脑在湿冰上解冻，使用 Rodent Brain Slicer Stainless Steel Matrix 进行冠状切片（约 150μm 厚），获取包含海马结构及相邻皮质和皮质下结构的目标区域。使用 Ambion RNAqueous Total RNA Isolation Kit 提取总 RNA，并通过 Agilent RNA 6000 Nano Bioanalyzer kit/instrument 检测。制备 Poly - A 富集的 mRNA 文库，在 Novogene 使用 Illumina TruSeq RNA Library Prep Kit 进行测序。

测序数据使用 STAR 软件比对到大鼠 UCSC rn7 基因组，利用 featureCounts 生成基因计数。使用 FastQC 评估数据质量，通过主成分分析（PCA）确定样本异常值。原始 RNA - seq fastq 文件和基因计数矩阵可在 GEO（GSE275431）获取。生物信息学分析使用 R 编程语言（版本 4.2.1）和 RStudio 集成开发环境（版本 2023.06.0），绘图使用 ggplot2 R 包（版本 3.4.0），RNA - seq 分析脚本可在https://github.com/NordNeurogenomicsLab/Publications/tree/master/MARA获取。

（六）差异表达和基因本体富集分析

差异表达（DE）分析使用 edgeR R 包。对于比较对照组和 MARA 样本的模型，筛选在至少 8 个样本中表达量不低于 1 count per million（CPM）的基因；对于测试单个 MARA - AB 模式差异表达的模型，该阈值设定为在至少 2 个样本中大于 1 CPM。使用主成分或 SVA 批次校正方法调整 DE 模型，以校正技术和性别相关变异。使用 Reads per kilobase per million mapped reads（RPKM）绘制单个基因表达数据。基因本体（GO）富集分析使用 topGO R 库。

（七）统计分析

对于存在少量缺失数据（0.1% - 16%）的分析物，如 eotaxin、leptin、IL - 2 等，将缺失值按批次以低于检测限（LOD）除以√2 进行插补；对于缺失数据较多（20% - 75%）的分析物，创建二分变量表示其是否低于检测限；缺失率高于 80% 的变量则从分析中排除。

由于数据具有层级结构，采用广义线性混合效应模型评估自身抗体暴露对后代大脑和血清中细胞因子 / 趋化因子 / 生长因子的影响。该模型可处理正态分布和二进制数据，通过随机截距控制窝内相关性，并对性别和窝数等协变量进行调整。为避免批次差异造成的混杂，针对不同批次数据分别拟合模型。使用线性混合效应模型计算标准化效应量（Cohen’s d）评估组间差异大小，所有模型假设通过图形和分析方法进行验证，假设检验为双侧，显著性水平 α = 0.05，分析在 SAS OnDemand version 9.4 中进行。

三、研究结果

（一）妊娠期自身抗体暴露改变后代大脑和血清中细胞因子 / 趋化因子 / 生长因子谱

通过线性混合效应模型比较 LDHA/B + CRMP1 + STIP1 免疫的母鼠后代与对照组后代 PND2 大脑和血清中细胞因子 / 趋化因子 / 生长因子水平。结果显示，暴露于 MARA - AB 的后代大脑中，IL - 1β、IL - 2 和 IL - 10 水平显著降低；血清中 EGF 水平显著升高。IL - 12p70 在大脑和血清中因检测值较低，作为二元变量分析，发现暴露组可检测读数显著低于对照组。这表明暴露于 LDHA/B + CRMP1 + STIP1 模式会导致大脑和外周细胞因子 / 趋化因子水平发生变化。

（二）不同 MARA - ABS 暴露导致后代细胞因子 / 趋化因子 / 生长因子水平差异

除 LDHA/B + CRMP1 + STIP1 模式外，研究诱导产生另外三种自身抗体模式（CRMP1 + CRMP2、CRMP1 + GDA 和 STIP1 + NSE）。分析发现，不同处理组间 IL - 2 水平存在显著差异，CRMP1 + CRMP2 暴露组大脑中 IL - 2 水平显著高于 CRMP1 + GDA 暴露组；CRMP1 + CRMP2 暴露组大脑中 VEGF 水平显著低于 CRMP1 + GDA 暴露组，且 CRMP1 + GDA 暴露组大脑中 VEGF 水平高于 STIP1 + NSE 暴露组。在血清水平上，未发现这三个处理组间存在统计学显著差异。此外，IFNγ 在 CRMP1 + CRMP2 暴露组大脑中检测频率显著高于 CRMP1 + GDA 和 STIP1 + NSE 暴露组；eotaxin 在 CRMP1 + CRMP2 暴露组血清中可检测值显著多于 CRMP1 + GDA 组。这说明 MARA 自身抗体对后代大脑和血清中细胞因子和趋化因子水平的影响因 MARA - ABS 模式而异。

（三）妊娠期 MARA - AB 暴露导致 PND2 大脑转录组变化

对暴露于四种 MARA - ABS 组合和盐水对照的 PND2 皮质样本进行 RNA 测序。数据集包含两个实验批次，通过 SVA 校正或 PCA - 基于的校正调整技术变异。PCA 分析未发现异常样本，但 PC1 和 PC2 与实验批次 / 队列存在强相关性，PC1 解释了数据中 96.8% 的方差，可能由组织解剖、发育时间或样本处理条件差异导致。样本性别与 PC5 - 7 显著相关。

在 DE 分析中，通过三个不同的 DE 模型检测，在严格的 FDR < 0.1 显著性阈值下，共鉴定出 31 个独特的差异表达基因，其中 21 个上调，10 个下调。GO 富集分析显示，上调基因与转录调控、DNA 修复和神经胶质细胞增殖相关；下调基因与转录调控相关。进一步按自身抗体暴露分层分析，发现 CRMP1 + CRMP2 暴露引发的 DE 反应最强，有超过 1390 个 DE 基因通过 FDR < 0.1；LDHA/B + CRMP1 + STIP1 暴露反应较弱，只有 10 个上调基因；CRMP1 + GDA 和 STIP1 + NSE 暴露上调基因分别只有 1 个和 2 个，且这三组均无下调基因通过 FDR < 0.1。

对不同自身抗体组合的 DE 基因列表进行交叉分析和定量相关性分析，发现不同暴露条件下虽定性交叉显示基因集相似性不高，但定量相关性表明存在相似性。利用 LDHA/B + CRMP1 + STIP1 和盐水对照样本的两个独立批次重复实验，验证了转录组效应的可重复性。对 CRMP1 + CRMP2 暴露的 DE 基因进行 GO 富集分析，发现上调基因与细胞 - 基质粘附和神经系统发育相关；下调基因与突触传递、神经元分化、能量产生和代谢以及翻译相关。

四、研究结论与讨论

本研究利用与临床相关的大鼠模型，深入探究妊娠期暴露于临床相关 MARA - AB 模式对出生后早期大脑基因表达和免疫信号分子的影响。在大鼠 PND2 时，其大脑神经发育过程与人类妊娠晚期相似，此时胎儿大脑在关键发育阶段易受外界因素影响，MARA - ABS 可通过胎盘进入胎儿体内，与靶蛋白相互作用，可能改变早期神经发育轨迹，影响细胞因子、趋化因子和生长因子等信号分子。

研究发现，LDHA/B + CRMP1 + STIP1 暴露的大脑中，几种促炎细胞因子水平显著降低，这些细胞因子对正常神经发育至关重要，其水平降低可能对后代大脑发育产生负面影响。血清中 EGF 水平升高，EGF 与神经元和神经胶质细胞增殖有关，可能导致 MARA 模型中大脑过度生长，这与先前在小鼠、大鼠和非人灵长类动物中的研究结果一致，表明大脑过度生长是 MARA 病理的一个特征。

在评估其他临床 MARA - AB 模式时，发现 CRMP1 + CRMP2 和 STIP1 + NSE 暴露后代大脑中 VEGF 水平降低，可能影响血脑屏障形成和神经元命运；CRMP1 + CRMP2 暴露后代大脑中 IL - 2 和 IFNγ 水平较高，可能对神经发育产生更严重影响。这与临床观察到的 CRMP1 + CRMP2 与更严重自闭症表型相关的结果相符，也暗示不同 MARA - ABS 反应谱可能导致 MARA 严重程度存在差异。

转录组分析显示，暴露于 MARA - ABS 的后代中，与转录调控、增殖和神经元分化相关的基因发生变化，这与自闭症患者中异常的神经元生长轨迹相似。例如，Wnt 信号通路基因上调，与自闭症患者中观察到的皮质神经元数量过多和大脑体积增大有关；同时，MAPK 和 NFκB 信号通路相关基因表达改变，这两条信号通路不仅与神经元发育密切相关，还参与多种细胞因子的释放，其功能改变可能直接影响细胞因子水平。

然而，本研究存在一定局限性。在细胞因子 / 趋化因子 / 生长因子比较中，受板间差异限制，统计效力有限，且未对多重比较进行校正，解释 P 值时需谨慎。此外，本研究采用批量 RNA 测序，未来研究需进一步探究单基因 DE 效应与蛋白质水平变化的关系，确定 DE 效应影响的具体细胞类型，并测试相关通路和过程的功能影响。

总体而言，该研究不仅证实 MARA 自身抗体暴露直接影响健康神经发育的关键因素，还发现不同 MARA 模式对后代的影响存在差异。这些发现为深入理解 MARA - ABS 的病理效应提供了重要依据，对揭示自闭症发病机制、开发早期诊断方法和干预措施具有重要意义，后续研究可在此基础上进一步深入探索，为自闭症研究和临床实践带来新的突破。