己糖激酶i直接与线粒体VDAC1和VDAC2的带电膜埋谷氨酸结合

细胞模拟和实验揭示了控制己糖激酶- 1与线粒体VDAC通道结合的核心结构和拓扑决定因素，其中VDAC上双层谷氨酸的质子化状态起着至关重要的作用。

　　

探秘 HKI-VDAC 复合体组装机制：结构与功能的新洞察

德国奥斯纳布吕克大学分子细胞生物学系的 Sebastian Bieker、Michael Timme 等研究人员在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Hexokinase-I directly binds to a charged membrane-buried glutamate of mitochondrial VDAC1 and VDAC2” 的论文。该研究揭示了己糖激酶 I（HKI）与线粒体电压依赖性阴离子通道（VDAC1 和 VDAC2）相互作用的关键机制，为理解细胞代谢调控、肿瘤发生和神经退行性疾病的病理过程提供了重要依据，也为开发针对相关疾病的治疗策略奠定了理论基础。

一、研究背景

电压依赖性阴离子通道（VDACs）是线粒体 outer membrane（OMM）上丰富的 β - 桶状蛋白，在离子、代谢物转运以及细胞凋亡调控等过程中发挥核心作用。在哺乳动物中，VDAC1 和 VDAC2 是大多数组织中表达最丰富的同工型，除了控制代谢物跨 OMM 的流动外，还作为磷脂转运蛋白和多种蛋白质的动态转运平台。

己糖激酶（HKs）能将葡萄糖磷酸化为葡萄糖 - 6 - 磷酸（G - 6 - P），HKI 和 HKII 与线粒体结合后会导致糖酵解和乳酸生成增加，即 Warburg 效应，这是肿瘤进展的重要特征。同时，线粒体结合的 HKs 能保护癌细胞免受药物诱导的线粒体凋亡，而脊髓中 HKI 浓度降低则与肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病相关。

尽管 HKI - VDAC 相互作用在癌症和神经退行性疾病中至关重要，但目前对于它们如何组装成复合体的结构基础尚不清楚。此前的研究模型存在诸多缺陷，未能充分解释关键的相互作用机制，VDAC 通道的膜拓扑结构也未明确，这限制了对其作为线粒体支架功能的全面理解。

二、研究材料与方法

（一）细胞系与培养

研究使用了人宫颈癌细胞系 HeLa、人结肠癌细胞系 HCT116 和人胚肾细胞系 HEK293T 。HeLa 细胞在添加特定成分的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，HCT116 细胞在 McCoy's 培养基中培养，HEK293T 细胞在添加 10% FBS 的 DMEM 中培养，所有细胞系均常规检测支原体污染。

（二）DNA 构建体

构建了多种 DNA 表达载体，如编码大鼠 HKI 的 pEGFP - HKI、编码 HKI - N - Halo 的 pSEMS - HKI - N - Halo 等 。通过融合 PCR 和限制性内切酶酶切连接等方法，将目的基因片段插入相应表达载体，并使用定点突变试剂盒引入单氨基酸替换，所有表达构建体均经 DNA 测序验证。

（三）细胞转染与基因编辑

利用聚乙烯亚胺（PEI）将 DNA 构建体转染到细胞中。通过 CRISPR/Cas9 技术敲除 HeLa 细胞中的 HKI 基因，以及敲除 HeLa 细胞中 VDAC1 和 VDAC2 基因，构建相应的基因敲除细胞系，筛选并验证敲除效果。

（四）蛋白质分析技术

运用亚细胞分级分离技术分离细胞的线粒体和胞质等组分，通过免疫印迹分析检测 HKI、HKII、VDAC1、VDAC2 等蛋白的表达水平。利用免疫荧光显微镜和活细胞成像技术，观察蛋白的亚细胞定位和细胞内动态变化，通过 Line scan 和 Pearson’s 相关系数分析评估蛋白共定位程度。

（五）计算模型与模拟

采用大鼠 HKI 和人 VDAC1 的晶体结构以及人 VDAC2 的同源模型进行分子动力学（MD）模拟。使用 Martini 3 力场进行粗粒化 MD 模拟，构建多种模拟系统，包括含 HKI - N 和不同状态 VDACs 的 OMM 脂质环境系统等。设置相应的模拟参数，进行能量最小化、平衡和生产运行，并对模拟结果进行多种分析，如计算蛋白与膜的相互作用、接触频率和持续时间、膜厚度和水缺陷等。

三、研究技术路线

首先，通过细胞实验观察 HKI 的线粒体定位情况，敲除 VDAC1 和 VDAC2 基因，检测 HKI 的定位变化，确定 VDACs 对 HKI 线粒体定位的影响。然后，利用生物信息学工具分析 HKI - N 的结构特征，通过 MD 模拟研究 HKI - N 与膜的结合亲和力以及关键氨基酸残基的作用。接着，进行 HKI - N 与 VDAC1 和 VDAC2 的 MD 模拟，探究膜拓扑结构和谷氨酸质子化状态对复合体形成的影响。同时，通过细胞实验调节胞质 pH，观察 HKI - N 的线粒体定位变化，验证理论模拟结果。最后，对 VDAC 通道附近的膜结构进行分析，确定参与膜变薄和促进 HKI - VDAC 结合的关键通道残基。

四、研究结果

（一）膜埋谷氨酸对稳定线粒体 HKI 池至关重要

研究人员通过在 HeLa 细胞中表达 GFP 标记的 HKI，并敲除 VDAC1 或 VDAC2，发现单独敲除两者之一对 HKI 线粒体定位影响不显著，但同时敲除则导致 HKI 无法定位于线粒体，而是在胞质中积累，重新引入 VDAC1 或 VDAC2 可恢复 HKI 的线粒体定位和表达。这表明 VDAC1 和 VDAC2 均有助于稳定线粒体中的 HKI 池。

进一步研究发现，VDAC1 和 VDAC2 跨膜区域中独特定位的谷氨酸（VDAC1 中的 Glu73 和 VDAC2 中的 Glu84）对 HKI 结合至关重要。将 VDAC1 中 Glu73 替换为 Gln 会消除其恢复 HKI 线粒体定位和表达的能力，VDAC2 中 Glu84 替换为 Gln 也有类似效果；而将 Glu 替换为 Asp 则能增强 HKI 的线粒体招募。由此可见，HKI 与 VDAC1 和 VDAC2 的结合高度依赖于通道外壁带负电的膜埋谷氨酸残基。

（二）HKI 的线粒体招募由其 N 端 α - 螺旋介导

HeliQuest 分析显示 HKI - N 形成具有极性和非极性面的 α - 螺旋。通过粗粒化分子动力学（CG - MD）模拟发现，HKI - N 肽能与模拟 OMM 的膜结合，其非极性面埋入膜的疏水核心，驻留时间大于 5000 ns。Leu7 作为膜定向非极性面的关键成分，将其替换为 Gln 会显著缩短 HKI - N 的膜驻留时间，并导致 GFP - HKI 在 HeLa 细胞中无法定位于线粒体。这些结果表明，HKI 的 N 端 α - 螺旋插入膜是其与 OMM 上 VDAC 结合的前提条件。

（三）膜埋谷氨酸的质子化直接控制 HKI - N 与 VDACs 的结合

通过可滴定 Martini 模拟估计，VDAC1 中 Glu73 的 pKa 值约为 4.8，VDAC2 中 Glu84 的 pKa 值约为 5.1，这意味着在中性 pH 条件下，它们主要处于去质子化的带负电状态。CG - MD 模拟显示，当通道的 C - 末端面向膜间隙（IMS）且膜埋谷氨酸去质子化时，HKI - N 能与 VDAC1 和 VDAC2 形成稳定接触，HKI - N 的 N - 末端一半垂直插入胞质膜小叶并直接与 Glu73 或 Glu84 结合；而谷氨酸质子化或通道 C - 末端面向胞质时，复合体形成受到严重抑制。

在细胞实验中，通过用尼日利亚菌素调节胞质 pH，发现胞质酸化会导致 Halo - 标记的 HKI - N 从线粒体转移到胞质，且这种转移是可逆的，pH 恢复后 HKI - N 可重新定位于线粒体。这表明 HKI - VDAC 结合受膜面谷氨酸质子化状态的控制。

（四）HKI - VDAC 结合严重依赖膜埋谷氨酸的不对称定位

MD 模拟观察到膜埋谷氨酸在 VDACs 中的不对称定位，当通道 C - 末端面向 IMS 时，谷氨酸位于胞质小叶，有利于 HKI 结合。为验证其重要性，研究人员构建了 VDAC1 突变体（将 Glu73 替换为 Phe，Phe71 替换为 Glu），MD 模拟显示该突变体无论膜取向如何，都无法与 HKI - N 形成稳定接触；在细胞实验中，该突变体也无法恢复 GFP - HKI 在 VDAC1/2 双敲除细胞中的线粒体定位。这表明通道外壁带电谷氨酸的双层深度虽然关键，但并非 HKI 结合的唯一决定因素，VDACs 膜面的其他独特特征也发挥作用。

（五）VDAC 通道导致膜埋谷氨酸附近的脂质单分子层变薄

对 VDAC1 和 VDAC2 进行 MD 模拟，发现其在与 HKI 结合的取向（C - 末端面向 IMS）下，会使胞质小叶靠近带负电谷氨酸（E73–）的区域出现明显的膜变薄现象，该区域的胞质小叶厚度明显小于通道壁其他区域或无蛋白时的膜厚度，同时伴有大量水渗透。突变实验表明，膜变薄能力可能由通道外壁其他极性残基介导，而非带电谷氨酸本身。

（六）膜埋谷氨酸附近的极性残基为 HKI - VDAC 结合提供通道

对 VDAC1 膜变薄区域的外壁进行检查，发现 Thr77 和 Ser101 两个极性残基靠近膜埋谷氨酸。CG - MD 模拟显示，将 Thr77 或 Ser101 替换为 Leu 会导致膜变薄能力降低，同时减少 HKI - N 与带电谷氨酸的接触；双突变进一步削弱结合能力，且这些突变体在细胞实验中恢复 HKI 线粒体招募的能力也受损。这表明 Thr77 和 Ser101 是膜变薄途径的核心成分，为 HKI 的 N - 末端 α - 螺旋接近膜埋谷氨酸提供通道，从而促进 HKI - VDAC 结合。

五、研究结论与讨论

该研究综合运用分子动力学模拟和细胞实验，揭示了 HKI 与 VDAC1 和 VDAC2 结合的关键结构和物理化学特征。膜面带负电的谷氨酸在促进通道与 HKI 的两亲性 N - 末端 α - 螺旋稳定接触中起关键作用，其质子化会阻断结合；一对极性通道残基 Thr77 和 Ser101 使胞质膜小叶变薄，为 HKI 的 N - 末端 α - 螺旋提供低能通道，促进复合体组装。

研究还表明，HKI - N 是与 VDAC 结合的关键区域，其膜分配是结合的前提，且 HKI - VDAC 复合体的组装是一个多步骤过程。同时，确定了 VDAC 通道在 OMM 中的取向，只有 C - 末端面向 IMS 时才能为 HKI 提供功能性结合平台。此外，研究发现胞质 pH 可通过调节膜面谷氨酸的质子化状态，直接决定 HKI 与线粒体的结合，这一机制在细胞代谢和疾病发展中具有重要意义。

HKI 与线粒体 VDACs 的结合对细胞生长、存活以及肿瘤发生、神经退行性疾病发展影响深远。肿瘤细胞中，HKI 与 VDACs 结合可保护细胞免受凋亡，促进糖酵解，而细胞内 pH 变化可调节两者结合，影响葡萄糖代谢途径。本研究为理解这些生理和病理过程提供了分子基础，也为开发针对肿瘤和神经退行性疾病的新型治疗化合物提供了理论框架，有望通过调节 HKI - VDAC 复合体的组装来干预相关疾病的进程。