通过减弱大肠杆菌乙酸代谢途径提高从头合成胞苷过程中的碳代谢通量分布

为解决乙酸作为胞苷合成副产物竞争碳通量、降低胞苷产量的问题，研究人员开展了敲除大肠杆菌中乙酸代谢关键基因 poxB 和 pta 的研究。结果显示，敲除后胞苷产量显著提高，这为优化微生物系统中胞苷高效生产提供了理论基础。

　　在微生物发酵生产领域，胞苷作为一种关键的嘧啶核苷，在 RNA 合成以及众多生理生化过程中发挥着不可或缺的作用，尤其是在制药行业，它是生产抗肿瘤和抗癌药物（如阿糖胞苷和环胞苷）的重要原料。目前，微生物发酵已成为胞苷生产的主要方法，而大肠杆菌因其良好的细胞特性和易于培养的特点，成为了理想的宿主。然而，在大肠杆菌发酵生产胞苷的过程中，乙酸作为代谢副产物会与胞苷合成竞争来自中心代谢的碳通量。一方面，大肠杆菌在高葡萄糖摄入时，无法完全氧化葡萄糖，会将乙酸作为能量储存的替代形式；另一方面，乙酸具有细胞毒性，不仅会破坏细胞膜的通透性，还会降低周围环境的 pH 值，进而影响细菌对碳源的摄取和利用，最终导致目标产物胞苷的产量下降。因此，如何优化大肠杆菌的代谢途径，减少乙酸生成，提高胞苷产量，成为了亟待解决的问题。
宁夏大学的研究人员针对这一问题展开了深入研究。他们利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，敲除了大肠杆菌中与乙酸代谢密切相关的 poxB 和 pta 基因，构建了工程菌株 K12ΔpoxB 和 K12ΔpoxBΔpta，并通过转录组和代谢组分析，探究基因敲除前后的变化。该研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为优化大肠杆菌作为胞苷生产的细胞工厂提供了新的思路和策略。
研究人员在此次研究中，主要运用了以下几种关键技术方法：一是 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，用于敲除大肠杆菌 K12MG1655 中的 poxB 和 pta 基因；二是转录组分析，在发酵 39 小时时提取不同菌株的总 RNA，进行高通量测序，分析基因表达水平和差异表达基因；三是代谢组分析，采用超高效液相色谱 - 串联质谱（UHPLC-MS/MS）系统对发酵液中的代谢物进行分析。
乙酸代谢关键基因敲除对胞苷生产的影响：通过 CRISPR-Cas9 技术成功敲除 poxB 和 pta 基因。生长曲线显示，敲除 poxB 对细菌生长影响较小，而敲除 pta 导致对数生长期显著延迟，但后期 K12ΔpoxBΔpta 菌株的 OD₆₀₀值更高，说明其促进了生物量积累。发酵过程中，K12ΔpoxB 和 K12ΔpoxBΔpta 菌株的 pH 下降更缓慢，表明乙酸代谢途径在大肠杆菌发酵产酸中起重要作用。糖消耗实验发现，敲除相关基因后，残留糖增加，意味着乙酸代谢基因下调减少了糖消耗，节约了碳源。在胞苷产量方面，39 小时发酵后，K12ΔpoxB 和 K12ΔpoxBΔpta 菌株的胞苷产量分别达到 1.91 ± 0.04 g/L 和 18.28 ± 0.22 g/L，远高于原始菌株 K12 的 1.58+0.03g/L，是目前报道的大肠杆菌摇瓶发酵中胞苷产量的最高水平，这表明抑制乙酸代谢途径是提高胞苷产量的有效策略。
转录组分析揭示 poxB 和 pta 敲除促进胞苷积累的机制：转录组测序结果显示，K12、K12ΔpoxB 和 K12ΔpoxBΔpta 菌株之间存在明显的表达模式差异。KEGG 富集分析表明，K12ΔpoxB 中上调的差异表达基因（DEGs）主要富集在核苷酸代谢、能量代谢和碳代谢途径，而下调的 DEGs 主要在信号转导途径，说明敲除 poxB 会引起碳代谢通量的重新分配，促进核苷酸和能量代谢，使碳通量向胞苷合成方向转移。在 K12ΔpoxBΔpta 中，上调的 DEGs 主要与能量代谢、碳代谢和核苷酸代谢相关，下调的 DEGs 则涉及碳代谢、脂质代谢和氨基酸代谢等，表明双敲除进一步促进了与胞苷合成相关途径的上调，同时抑制了胞苷分解代谢途径。此外，在糖酵解、TCA 循环和胞苷合成途径中，不同菌株的基因表达存在差异。例如，K12ΔpoxB 中糖酵解相关基因普遍上调，而 K12ΔpoxBΔpta 中 pgi 基因显著下调；TCA 循环中，K12ΔpoxBΔpta 的部分基因变化影响了琥珀酸等关键底物的生成，进而促进胞苷合成；胞苷合成途径中，相关基因的表达变化影响了胞苷的代谢平衡。RT-qPCR 验证结果与转录组数据一致，证明了转录组分析的可靠性。
代谢组分析揭示大肠杆菌中 poxB 和 pta 缺失的代谢调控差异：代谢组分析发现，敲除 poxB 和 pta 基因主要影响了大肠杆菌的乙酸代谢、核苷代谢和碳代谢通量。差异丰富的代谢物主要包括羧酸及其衍生物、脂肪酸、有机氧化物、嘧啶核苷等，这些代谢物在调节细胞内 pH、能量代谢、细胞信号传导等方面具有重要作用。KEGG 功能富集分析显示，差异丰富的代谢物主要富集在细胞环境信息处理和代谢类别中，表明敲除相关基因可改变细胞膜通透性和细胞代谢过程。与 K12 相比，K12ΔpoxB 中差异丰富的代谢物与氨基酸代谢、核苷酸代谢等相关；K12ΔpoxBΔpta 中则与氨基酸代谢、核苷酸代谢、辅因子生物合成等相关，且双敲除菌株激活了酸回填途径，促进了酸性氨基酸和核苷酸的合成，有利于细菌生长。通过热图分析发现，K12ΔpoxB 中氨基酸和核苷等代谢物上调，而 K12ΔpoxBΔpta 中胞苷显著上调，乙酸等有机酸下调，进一步证明敲除 poxB 和 pta 基因可促进碳通量向胞苷合成方向转移。
研究结论和讨论部分指出，敲除 poxB 和 pta 基因可使大肠杆菌发酵过程中 pH 下降更缓慢，乙酸产量大幅降低，胞苷合成显著增加。转录组和代谢组分析表明，这些变化与细胞内 pH 改变和碳通量重排有关，突出了乙酸代谢在调节大肠杆菌胞苷生物合成中的关键作用，为优化大肠杆菌生产胞苷提供了新的见解和策略。不过，该研究也存在一定局限性，如未准确计算胞苷合成的理论产量，单敲除 pta 基因对胞苷生产的具体影响也未深入剖析。未来研究可进一步优化大肠杆菌的氨基酸和核苷酸代谢途径，以彻底消除酸抑制的代谢途径，提高胞苷产量。总体而言，这项研究为微生物发酵生产胞苷领域提供了重要的理论依据和实践指导，有助于推动相关产业的发展。