三种耐吉西他滨人肝内胆管癌细胞系的建立和鉴定

　　

探究肝内胆管细胞癌吉西他滨耐药机制的重要进展 —— 解读 [论文标题]

绍兴市人民医院肝胆胰外科的研究人员联合其他单位，在Scientific Reports期刊上发表了题为 “Establishment and characterization of three gemcitabine-resistant human intrahepatic cholangiocarcinoma cell lines” 的论文。该研究构建并鉴定了吉西他滨（GEM）耐药的肝内胆管细胞癌（ICC）细胞系，对深入理解 ICC 的耐药机制，以及为开发新的治疗策略提供了关键的理论依据和实验基础，具有重要的临床意义和科研价值。

一、研究背景

ICC 是一种源于肝内二级及以上胆管上皮细胞的高度恶性肝脏肿瘤，占所有肝脏恶性肿瘤的 10 - 15%。与肝细胞癌相比，其恶性程度更高，预后更差。由于多数患者确诊时已处于疾病晚期，手术切除机会有限，即使部分早期患者接受手术，术后复发率也极高。以 GEM 为基础的治疗方案虽对不可切除的患者有一定疗效，但 ICC 患者在治疗过程中极易产生获得性耐药，导致治疗效果大打折扣，患者生存率难以提高。因此，探究 ICC 对 GEM 产生获得性耐药的内在机制迫在眉睫。

GEM 作为一种核苷类似物化疗前药，主要通过核苷转运体进入细胞，经磷酸化激活后，抑制核糖核苷酸还原酶，阻碍 DNA 合成，诱导细胞周期停滞在 G0/G1 期，从而发挥抗癌作用。在胰腺癌研究中，已揭示多种 GEM 耐药机制，但 ICC 中 GEM 耐药机制仍不明确，亟待深入探索。

二、研究材料与方法

（一）实验材料

研究中使用的 GEM 由绍兴市人民医院提供，众多检测试剂盒、抗体、细胞培养相关试剂等均购自国内外知名生物技术公司，实验所用细胞系包括 HCCC - 9810、RBE 和 HuH28，分别来源于中国科学院上海细胞库和研究团队实验室。

（二）实验方法

1. 诱导 GEM 耐药细胞系：采用逐步增加 GEM 浓度的方法诱导耐药细胞系。细胞先在 1nM GEM 中处理 72h，存活细胞在无药培养基中培养至 80% 融合，再维持在该浓度培养至生长稳定，随后提高药物浓度，持续 9 个月，之后液氮冻存 3 个月再复苏，用 CCK - 8 法评估耐药性。
2. 多种检测实验：通过化学敏感性检测（CCK - 8 法）、细胞生长实验（CCK - 8 法监测细胞增殖）、集落形成实验、细胞周期分析（流式细胞术）、DNA 损伤检测（免疫荧光染色结合显微镜观察）、3D 球状体生长实验、ROS 检测实验（流式细胞术）等多种实验，从不同角度评估细胞对 GEM 的耐药特性、细胞增殖和肿瘤形成能力、DNA 损伤程度以及 ROS 水平等。
3. 基因和蛋白相关实验：运用 siRNA 转染技术下调特定基因表达，通过实时聚合酶链反应（qRT - PCR）检测基因表达水平，利用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析蛋白表达情况。
4. 数据分析：收集并整合公共数据库（GSE116118）和实验室自身数据（DGSR - ICC），运用 R 语言进行数据处理，包括去除批次效应、标准化处理，筛选差异表达基因（DEGs），进行基因本体（GO）富集分析，利用多种统计软件进行统计学分析。

三、研究结果

（一）ICC 细胞系中 GEM 耐药性的建立

通过上述诱导方法成功建立了 GEM 耐药的 ICC 细胞系。细胞活力曲线显示，耐药细胞系对 GEM 诱导的毒性耐受性显著增强，且不同细胞系耐药程度存在差异，HCCC - 9810 耐药性最强，HuH28 次之，RBE 最弱。细胞生长曲线和集落形成实验进一步证实，耐药细胞系在 GEM 存在下仍能持续增殖。

（二）GEM 耐药细胞系中 G0/G1 细胞周期停滞和致瘤性抑制减弱

流式细胞术分析表明，GEM 处理 24h 后，亲本细胞出现明显的 G0/G1 期停滞，而耐药细胞系细胞周期分布与未处理组相比无差异，能够正常增殖。3D 球状体生长实验发现，GEM 处理后，亲本细胞形成的球状体尺寸小于耐药细胞，说明耐药细胞的致瘤性抑制作用减弱。

（三）耐药细胞系中 GEM 诱导的 H2AX 磷酸化减少

免疫荧光检测显示，几乎所有亲本细胞的细胞核中都能观察到 γ - H2AX 焦点，而耐药细胞系细胞核中很少见，这表明 GEM 诱导的 DNA 损伤在耐药细胞系中显著减弱。

（四）ICC 细胞系中 GEM 耐药与 PI3K/Akt 和 EMT 通路无关

对 PI3K/Akt、EMT 通路相关基因和蛋白，以及 p53R2、IGF - 1R 等靶点的检测发现，不同 ICC 细胞之间这些基因和蛋白的表达没有明显差异，说明这些通路和靶点可能与 ICC 对 GEM 的耐药性发展无关。

（五）对氧化应激的高耐受性与 ICC 细胞耐药相关

研究发现，ICC 细胞经 GEM 处理后，抗氧化酶 SOD2 表达上调。耐药细胞系的基础 ROS 水平显著高于亲本细胞，且在 GEM 处理后，耐药细胞系的 ROS 升高幅度不如亲本细胞明显。敲低 SOD2 进一步增强了 ICC 细胞对 GEM 的耐药性，表明 ROS 在促进 ICC 对 GEM 耐药的发展中起关键作用。

（六）MAPK 级联是 ICC 中 GEM 耐药分子机制的候选通路

对耐药细胞系进行转录组分析，筛选出差异表达基因，GO 富集分析显示这些基因与 MAPK 级联的负调控显著相关。结合公共数据集分析，发现多个差异表达基因，后续研究将聚焦于这些基因与 ROS 的关系。

四、研究结论与讨论

本研究成功构建并鉴定了 GEM 耐药的 ICC 细胞模型，该模型在细胞增殖、细胞周期和 DNA 损伤方面表现出与亲本细胞显著不同的特性，且这种获得性耐药具有稳定性。研究表明，在 ICC 对 GEM 的耐药机制中，EMT、PI3K/Akt、p53R2 和 IGF - 1R 等通路和靶点未发挥关键作用，而 ROS 可能是促进耐药发展的重要因素。此外，MAPK 级联可能参与其中，但具体机制仍需进一步研究。

以往研究提示 EMT 在部分癌症的耐药过程中发挥重要作用，但在本研究的 ICC 耐药模型中，未发现 EMT 通路介导 GEM 耐药的证据，不同细胞间 EMT 相关基因表达波动不一致，可能与胆管恶性肿瘤的异质性有关。对于 p53R2 和 IGF - 1R，虽有研究表明其与 GEM 疗效相关，但本研究未发现它们在 ICC 耐药中的显著差异。

ROS 与耐药性密切相关，在多种癌症中参与耐药机制。本研究中，ICC 细胞在 GEM 处理后 SOD2 上调，耐药细胞系基础 ROS 水平更高，且敲低 SOD2 增强了耐药性，这些结果均表明靶向 ROS 水平可能成为克服 ICC 对 GEM 耐药的潜在治疗策略。MAPK 信号通路在肿瘤化疗耐药中作用复杂，本研究发现耐药细胞中差异表达基因负调控 MAPK 通路，与以往部分研究结果不同，这可能反映了 MAPK 信号在不同细胞类型和条件下的差异。

研究还观察到耐药 ICC 细胞存在基因表达差异，可能源于特定突变，这些突变影响 DNA 修复机制和细胞对治疗的反应。通过与公共数据集对比，发现部分基因在其他癌症化疗耐药中已有研究，但在 ICC 中的作用仍待确定。后续需进一步探究这些基因表达变化与突变的关系，以及突变如何影响耐药机制。

总体而言，该研究成果为深入探究 ICC 对 GEM 耐药的内在机制提供了重要依据，所建立的耐药模型将有助于后续研究寻找新的治疗靶点和策略，为改善 ICC 患者的临床治疗效果、提高生存率带来新的希望。