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肝内胆管癌（ICC）预后差，对吉西他滨（GEM）易产生耐药性。研究人员建立 3 种 GEM 耐药 ICC 细胞模型，发现 ROS 可能促进耐药，MAPK 级联是潜在耐药机制。该研究为探索 ICC 耐药机制及新疗法提供了重要依据。
肝内胆管癌（ICC）是一种恶性程度极高的肝脏肿瘤，近年来其发病率呈显著上升趋势。在过去的四十年间，ICC 的发病率激增超过 140%。然而，目前针对 ICC 的治疗手段十分有限，仅有 20 - 30% 的患者有机会接受根治性切除手术，且 5 年生存率仅为 20 - 35% 。对于晚期患者而言，以吉西他滨（GEM）和铂类药物联合的化疗方案虽为一线治疗选择，但多数患者在治疗几个月后就会出现耐药现象，一线化疗失败后可供选择的治疗方案少之又少，不到一半的患者能接受二线治疗，患者预后极差。正是在这样严峻的治疗困境下，深入探究 ICC 对 GEM 产生耐药的机制显得尤为迫切，这对于改善 ICC 患者的临床治疗效果、提高患者生存率意义重大。
绍兴人民医院的研究人员为了攻克这一难题，开展了相关研究。他们成功建立了三种 GEM 耐药的 ICC 细胞系，并通过一系列实验对其耐药特性进行了深入研究，最终发现活性氧（ROS）可能在促进 ICC 对 GEM 耐药的过程中发挥关键作用，同时还确定了 MAPK 级联是 GEM 耐药潜在的分子机制之一。这一研究成果发表在《Scientific Reports》上，为后续探索 ICC 耐药的内在机制以及开发新的治疗方法奠定了坚实基础。
研究人员在本次研究中运用了多种关键技术方法。首先，通过体外培养人 ICC 细胞系（HCCC - 9810、RBE 和 HuH28），并使其长期暴露于逐渐增加浓度的 GEM 中，诱导出 GEM 耐药细胞系。其次，采用了 CCK - 8 法、细胞增殖实验、集落形成实验、细胞周期分析、DNA 损伤检测、3D 球状体生长实验、ROS 检测等多种实验方法，从不同角度对细胞的耐药性、增殖能力、细胞周期、DNA 损伤以及 ROS 水平等进行检测分析。此外，还运用了 siRNA 转染技术下调相关基因表达，通过实时聚合酶链反应（RT - PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）分析相关基因和蛋白的表达水平变化。同时，结合已有的公开数据集（GSE116118）和实验室自身数据集（DGSR - ICC）进行生物信息学分析，筛选差异表达基因（DEGs）并进行富集分析。
研究结果
- GEM 耐药 ICC 细胞系的建立：通过逐步增加 GEM 浓度的方法成功诱导出 GEM 耐药的 ICC 细胞系。细胞活力实验表明，耐药细胞系对 GEM 的耐受性显著增强，且不同细胞系耐药程度存在差异，HCCC - 9810 耐药性最强，其次是 HuH28 和 RBE。细胞增殖和集落形成实验进一步证实，即使在 GEM 存在的情况下，耐药细胞系仍能持续增殖123。
- GEM 耐药细胞系的细胞周期和致瘤性变化：经 GEM 处理 24 小时后，亲本细胞出现明显的 G0/G1期阻滞，无法正常增殖；而耐药细胞系的细胞周期分布与未处理的对照组相比无明显差异，能够正常增殖。在 3D 球状体生长实验中，经 GEM 处理后，亲本细胞形成的球状体体积明显小于耐药细胞，表明耐药细胞的致瘤性更强45。
- GEM 诱导的 DNA 损伤在耐药细胞系中的变化：免疫荧光实验检测 H2AX 磷酸化水平发现，经 GEM 处理后，几乎所有亲本细胞的细胞核中都能观察到 γ - H2AX 焦点，而耐药细胞系细胞核中则很少见，这表明 GEM 诱导的 DNA 损伤在耐药细胞系中显著减弱678。
- GEM 耐药与 PI3K/Akt 和 EMT 通路的关系：研究人员检测了 PI3K/Akt、EMT 通路相关蛋白以及凋亡相关蛋白的表达，发现不同 ICC 细胞系中相关基因的表达并无明显差异，这表明 GEM 耐药与 PI3K/Akt 和 EMT 通路无关。同时，对 p53R2 和 IGF - 1R 的表达分析也显示，它们与 GEM 耐药的发展没有显著关联910。
- 氧化应激与 ICC 细胞耐药的关系：研究发现，GEM 处理后 ICC 细胞中抗氧化酶 SOD2 表达上调，且耐药细胞系的基础 ROS 水平显著高于亲本细胞。进一步研究发现，敲低 SOD2 可增强 ICC 细胞对 GEM 的耐药性，这表明 ROS 在促进 ICC 对 GEM 耐药的过程中发挥重要作用1112。
- MAPK 级联与 GEM 耐药的关系：通过对耐药细胞系的转录组分析，筛选出差异表达基因，并进行 GO 富集分析，发现这些基因与 MAPK 级联的负调控显著相关，提示 MAPK 级联可能是 GEM 耐药的潜在分子机制13。
研究结论与讨论
本研究成功建立并验证了 GEM 耐药的 ICC 细胞模型，这一模型为深入研究 ICC 对 GEM 耐药的内在机制提供了可靠工具。研究发现，在该模型中，GEM 耐药并非由 EMT 途径介导，PI3K/Akt、p53R2 和 IGF - 1R 等靶点也与耐药的发展无关。而 ROS 在促进 ICC 对 GEM 耐药的过程中扮演了重要角色，靶向 ROS 水平有望成为克服 ICC 获得性耐药的一种治疗策略。此外，研究还发现 MAPK 信号通路在耐药细胞中呈现负调控，但其与化疗敏感性之间的关系较为复杂，可能因细胞类型和条件而异。同时，研究中观察到耐药细胞系存在基因表达差异，这可能与特定突变的获得有关，这些突变可能影响 DNA 修复机制和细胞对治疗的反应。后续还需要进一步研究这些基因表达变化与特定突变之间的关系，以及这些突变如何影响耐药机制。总体而言，本研究为深入理解 ICC 对 GEM 耐药的机制提供了重要线索，为开发新的治疗策略提供了理论依据，具有重要的科学意义和临床应用价值。
