临床分离肠球菌产生的细菌素及其对包括VRE在内的肠球菌的抗菌活性的综合分析

　　

肠球菌临床分离株细菌素的综合解析：基因分布、抗菌活性与潜在应用

在当今微生物研究领域，日本广岛大学的研究人员取得了一项重要进展。来自广岛大学的 Ayumi Fujii、Miki Kawada - Matsuo 等学者在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Comprehensive analysis of bacteriocins produced by clinical enterococcal isolates and their antibacterial activity against Enterococci including VRE” 的论文。该研究对肠球菌临床分离株产生的细菌素及其抗菌活性进行了全面分析，这一成果对于深入了解肠球菌的生物学特性、应对耐药菌感染问题具有重要意义。

研究背景

肠球菌作为一种兼性革兰氏阳性共生菌，主要栖息在人体的肠道和口腔中。然而，它并非总是 “安分守己”，在特定情况下会引发机会性医院感染，如胆道或泌尿道感染、菌血症以及心内膜炎等，其中粪肠球菌和屎肠球菌更是主要的人类病原体。近年来，耐药肠球菌的出现和传播成为全球医疗领域的棘手难题，尤其是耐万古霉素肠球菌（VRE），它极易对老年人和免疫功能低下者造成严重感染。因此，寻找新型抗菌药物迫在眉睫。

细菌素作为一类有望成为新型抗菌药物的候选物质，受到了广泛关注。它是由细菌产生的抗菌肽，主要来源于革兰氏阳性菌。与传统抗菌药物相比，细菌素的抗菌谱较窄，通常对同属或同种细菌有效。目前，细菌素主要分为三类：翻译后修饰肽（如羊毛硫抗生素）、未修饰细菌素（如片球菌素样细菌素和双肽细菌素）以及大型热不稳定蛋白。此前已有研究报道肠球菌能产生多种细菌素，但针对众多肠球菌菌株中细菌素的综合分析却较为匮乏。

研究材料与方法

细菌菌株

研究人员选用了多种细菌菌株，其中肠球菌分离株包括鸟肠球菌、铅黄肠球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌和棉子糖肠球菌等临床分离株，还纳入了耐万古霉素的粪肠球菌和屎肠球菌临床菌株。此外，大肠杆菌 XL - II、鲍曼不动杆菌 HN - 125、表皮葡萄球菌 KSE3 和金黄色葡萄球菌 MW2 也在研究范围内。这些菌株均在 37°C 有氧条件下，于胰蛋白酶大豆肉汤中培养。

细菌素基因鉴定

对 118 株临床肠球菌分离株进行 Illumina 全基因组测序，之后借助 BAGEL4 网络服务器和 ABRicate 软件，依据已知细菌素基因的核苷酸序列进行搜索。同时，从 NCBI Genbank 获取相关序列，并使用 ncbi - genomedownload 工具获取粪肠球菌和屎肠球菌的完整基因组序列，以分析万古霉素耐药基因的存在情况。

系统发育树分析

基于核心基因组比对构建粪肠球菌和屎肠球菌分离株的系统发育树。先利用 Prokka 对组装的 fasta 文件进行注释，再通过 Panaroo 管道将获得的 gff 文件与核心基因组比对，随后使用 RAxML - NG 生成最大似然树，并借助 Interactive Tree of Life 软件进行注释。同时，进行多位点序列分型（MLST）分析，通过 NCBI BLAST 研究氨基酸序列同一性，利用 SnapGene 获取氨基酸比对结果，使用 Easyfig 对遗传比较进行可视化。

软琼脂覆盖试验

该试验用于评估每种细菌素的抗菌活性。将 118 株肠球菌菌株在胰蛋白酶大豆肉汤中过夜预培养，取菌液点种在 TSA 平板上培养形成菌苔。把指示菌株也进行过夜预培养，然后将其与预热的半强度 TSA 琼脂培养基混合，倒在含有菌苔的平板上继续培养。测量抑菌圈直径，以评估抗菌活性。粪肠球菌 JARB - HU0683、屎肠球菌 JARB - HU0748 以及 8 株 VRE 菌株被用作指示菌。

细菌素基因表达定量

将肠球菌分离株过夜培养物调整至 OD660nm 值为 1.0，稀释后点种在 TSA 琼脂培养基上培养，收集菌落提取总 RNA，去除 DNA 污染后测定 RNA 纯度和浓度，将 RNA 逆转录为 cDNA，以其为模板进行定量 PCR，计算相关基因的表达量。

统计分析

运用 GraphPad Prism 10.1.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA），并使用 Dunnett 事后多重比较检验进行组间比较。

研究结果

肠球菌分离株中细菌素基因的鉴定

在 80 株粪肠球菌中，鉴定出细胞溶素基因（61.3%）、肠溶素 A 基因（27.5%）和 BacL 基因（45.0%）；在 38 株屎肠球菌中，鉴定出肠球菌素 A 基因（97.4%）、肠球菌素 B 基因（2.6%）、肠球菌素 NKR - 5 - 3B 基因（21.0%）、细菌素 T8 基因（36.8%）和 BacAS9 基因（23.7%）。部分菌株存在细菌素基因的双重或三重阳性情况。

细菌素氨基酸序列的变异

不同菌株中细菌素的氨基酸序列存在一定变异。如肠球菌素 A、肠球菌素 NKR - 5 - 3B 和 BacAS9 在各自菌株中氨基酸序列完全保守；细胞溶素阳性菌株中，多数菌株的细胞溶素 L 和 S 氨基酸序列相同，但有部分菌株存在氨基酸替换或融合现象；肠溶素 A 和 BacL 阳性菌株中，也有部分菌株的氨基酸序列存在差异。

对粪肠球菌和屎肠球菌的抗菌活性

通过软琼脂覆盖试验发现，不同细菌素阳性菌株对粪肠球菌 JARB - HU0683 和屎肠球菌 JARB - HU0748 的抗菌活性各异。肠溶素 A 阳性的粪肠球菌菌株对屎肠球菌 JARB - HU0748 有较强抑制活性，但多数对粪肠球菌 JARB - HU0683 无活性；细胞溶素单阳性菌株对两种指示菌活性较弱；BacL1 单阳性的粪肠球菌菌株对粪肠球菌 JARB - HU0683 有抗菌活性，但对屎肠球菌 JARB - HU0748 无活性。在屎肠球菌菌株中，细菌素 T8 或 BacAS9 阳性菌株对粪肠球菌 JARB - HU0683 和屎肠球菌 JARB - HU0748 有较强活性，而多数肠球菌素 A 或肠球菌素 B 单阳性菌株无活性。

分离株中细菌素基因的表达

研究人员对部分代表性菌株的细菌素基因表达进行检测。结果显示，具有抗菌活性的细菌素单阳性菌株中，BacL1、细胞溶素和肠溶素 A 等基因均有表达，但细胞溶素的表达量相对较低。在双阳性和三阳性菌株中，不同细菌素基因的表达存在差异，且与抗菌活性相关。

对其他肠球菌物种和其他细菌的抗菌活性

部分携带不同细菌素的菌株对其他肠球菌物种如鸟肠球菌、棉子糖肠球菌、铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌有抗菌活性，但对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌等无活性。不同细菌素阳性菌株的抗菌谱存在差异。

系统发育树分析

粪肠球菌中，ST179 和 ST16 占比较高，且携带特定细菌素基因并表现出相应抗菌活性；屎肠球菌中，ST17 和 ST547 占比较高，但菌株的序列类型与细菌素基因之间没有明显的相关性。

对 VRE 的抗菌活性

研究发现，细胞溶素基因阳性菌株对部分 VRE 菌株抗菌活性较弱；BacL 基因阳性菌株仅对部分粪肠球菌 VRE 有活性；肠溶素 A 阳性菌株对屎肠球菌 VRE 有活性；细菌素 T8 或 BacAS9 阳性菌株对所有测试的 VRE 菌株均有抗菌活性。

研究结论与讨论

本研究全面分析了粪肠球菌和屎肠球菌临床分离株中细菌素基因的分布情况及其抗菌活性。研究发现，不同肠球菌菌株携带的细菌素基因存在差异，且这些细菌素对不同菌株的抗菌活性呈现多样化特点。部分携带多种细菌素基因的菌株被鉴定出来，不同类型细菌素的抗菌模式也得到明确。此外，研究还评估了细菌素对 VRE 菌株的抗菌活性，发现细菌素 T8 和 BacAS9 对 VRE 具有抗菌活性，有望成为预防 VRE 感染的候选抗菌剂。

然而，研究也存在一定局限性，如所用菌株均来自一所大学医院，细菌素基因的分布可能无法反映普遍情况。但考虑到菌株序列类型的多样性以及之前报道的医院内无明显传播情况，样本偏差的影响相对较小。

总体而言，该研究为深入了解肠球菌细菌素提供了丰富信息，有助于开发新型抗菌策略应对耐药菌感染问题，在抗菌药物研发和临床感染治疗方面具有重要的理论指导意义和潜在应用价值，为后续相关研究奠定了坚实基础，有望推动微生物抗菌领域的进一步发展。