全长抑制蛋白是干扰人dUTPase活性最有效的蛋白

　　

探究 Stl 蛋白对人 dUTPase 抑制作用的研究解读

匈牙利布达佩斯技术与经济大学化工与生物技术学院应用生物技术与食品科学系等多单位的研究人员 Bianka K?hegyi、Zoé S. Tóth 等人，在Scientific Reports期刊上发表了题为 “Full-length inhibitor protein is the most effective to perturb human dUTPase activity” 的论文。该研究对于深入理解 dUTPase 酶的生理功能、开发针对相关疾病的治疗药物以及探究蛋白质 - 蛋白质相互作用机制具有重要意义。它为后续研究提供了关键的理论基础和实验依据，有望推动相关领域的进一步发展。

一、研究背景

dUTPase 酶在预防 DNA 修复过程中起着关键作用，它能够将 dUTP 从 DNA 生物合成途径中清除，同时产生 dUMP，为 dTTP 的生物合成提供前体。若 dUTPase 酶活性缺失，细胞内 dUTP 水平会升高，由于大多数聚合酶无法区分 dUTP 和 dTTP，这会导致在 DNA 合成或修复过程中尿嘧啶掺入基因组的频率增加。虽然存在尿嘧啶 - DNA 糖基化酶等 DNA 修复酶，可从 DNA 中切割尿嘧啶，但当 dUTPase 酶功能受到干扰，尿嘧啶碱基切除修复机制不堪重负时，就会引发 DNA 片段化和细胞死亡。基于 dUTPase 酶的这一重要作用，它成为了肿瘤治疗药物设计以及对抗病原微生物研究的焦点。

在研究 dUTPase 酶的生理功能方面，选择性抑制剂至关重要。在小鼠实验中，dUTPase 基因敲除会导致胚胎早期致死，但目前针对人细胞系的 dUTPase 基因敲除研究尚未成功。现有的一种有效的小分子人 dUTPase 抑制剂 TAS - 114，因其同时抑制二氢嘧啶脱氢酶，并不适合用于 dUTPase 的机制研究。而蛋白质类抑制剂因其潜在的高选择性，能减少细胞内的脱靶效应，为细胞内酶抑制作用的研究提供了有前景的工具。此前研究发现，噬菌体相关的尿嘧啶 - DNA 糖基化酶抑制剂在体外和体内都能显著降低人酶的活性。

研究人员在前期工作中发现，φ11 和 80α 噬菌体的 dUTPases 与参与金黄色葡萄球菌致病岛调节的葡萄球菌 Stl 蛋白相互作用。通过氢氘交换质谱（HDX - MS）等多种方法研究发现，Stl 蛋白的一个短片段可与 φ11 噬菌体和人 dUTPase 的活性位点结合，阻断底物进入口袋。并且，Stl 蛋白对多种 dUTPase 都有抑制作用，只是对不同物种的 dUTPase 抑制程度有所差异，例如对 φ11 噬菌体 dUTPase 几乎能完全使其失活，而人 dUTPase 在加入大量过量的 Stl 蛋白后仍保留 30% 的活性。基于这些前期研究成果，本研究旨在进一步探究 Stl 蛋白对人 dUTPase（hDUT）的抑制作用，并通过对 Stl 蛋白进行工程改造，增强其对 hDUT 的抑制效力。

二、研究材料与方法

（一）蛋白质制备

利用 NEB Q5 诱变试剂盒构建编码 Stl 突变体的质粒，通过 NEBaseChanger 网络工具设计引物。为便于生物膜干涉测量，在 Stl （残基 1 - 159）和 Stl （残基 175 - 267）蛋白的羧基末端引入 Avi - tag（MSGLNDIFEAQKIEWHE）。将编码人 dUTPase 的基因克隆到 PAN4 载体中，并与 N 末端 Avi - tag 框内融合，通过测序验证构建体的有效性。

（二）蛋白质表达与纯化

按照先前工作所述方法表达和纯化 Stl 变体和人 dUTPase 蛋白。对于生物膜干涉（BLI）实验所需的生物素化 Stl 构建体，在纯化过程中加入 50μM 生物素和在 0.5L 肉汤中于 18°C 培养过夜的大肠杆菌 AVB101 菌 pellet，以将生物素化酶（BirA）引入裂解物中。生物素化人 dUTPase 在含有 100μg/ml 氨苄青霉素和 10μg/ml 氯霉素的 500ml LB 培养基中，于 18°C 过夜培养的大肠杆菌 AVB101 细胞中表达，在 OD600 = 0.6 时加入 1.5mM IPTG 和 50μM 生物素。用于抑制研究的 95 - DKMYSYVNKAYYNDGDIYYSSYD - 117 肽从 GeneScript 订购。

（三）稳态 dUTPase 活性测定

在 25°C 下，通过监测 dUTP 水解过程中质子释放导致的酚红 pH 指示剂在 559nm 处吸光度的变化，来测量有无 Stl 变体存在时稳态 dUTPase 酶的活性。反应体系为 1mM HEPES、150mM KCI、5mM MgCl?、40μM 酚红，pH7.5。在 25°C 下，将 50nM 人 dUTPase 与 300nM 或不同浓度的 Stl 变体预孵育 5 分钟后，加入 30μM dUTP（）启动反应，每个样品进行三次平行测量，通过反应进程曲线前 10% 的斜率确定初始速度，并使用二次结合方程拟合 Stl 变体抑制数据。

（四）生物膜干涉测量

使用配备链霉亲和素包被的 SAX 生物传感器的 Octet K2 系统，在 30°C、含有 50mM HEPES、300mM NaCl、5mM MgCl?、pH7.5 的缓冲液中，采用至少五种不同稀释度研究蛋白质 - 蛋白质结合，使用 Octet Data Analysis HT 程序对数据进行 1:1 结合模型拟合。

（五）结晶与晶体学

将 StlNT 和 hDUT 蛋白分别在 50mM HEPES、300mM NaCl、5mM MgCl?、pH7.5 的缓冲液中，通过 Superdex 200 10/300 GL 柱在 ?KTA Explorer 纯化系统中进行凝胶过滤。将 StlNT 和 hDUT 以 1:1 单体摩尔比混合并浓缩至约 20mg/ml，在 20°C 下，采用悬滴气相扩散法，将浓缩的蛋白质溶液与 1.5M 硫酸铵、0.1M 醋酸钠（pH5）（Molecular Dimensions ProPlex F11）溶液按 1:1 混合生长晶体。在意大利的 Elettra 同步加速器 11.2CXRD2 光束线（波长 1.000 ?）收集衍射数据，使用 XDS 和 SCALA 进行数据处理，利用 CCP4 软件包中的 PHASER 通过分子置换法解决相位问题，使用 Coot 和 Phenix 软件包进行模型构建和精修。

（六）蛋白质结构预测

运用 AlphaFold 对蛋白质结构进行预测，以研究 Stl 突变对其自身二聚化以及与 hDUT 形成复合物的潜在影响。分别使用全长 Stl（UniProt: Q9F0J8）和 hDUT（UniProt: P33316 - 2，去除核定位信号 1 - MPCSEETPAISPSKRARPAEVGG - 23 序列元件）的序列，各生成 5 - 5 个模型。将设计的突变引入 Stl 序列，使用 2 个拷贝分析突变对 Stl 二聚化的影响，使用 3 个拷贝的 Stl 突变体和 1 个 hDUT 三聚体作为输入，进行 hDUT:Stl 复合物建模。

（七）蛋白质结构比较

利用 PyMOL 2.5.4 中的 cealign 和 align 命令，对 dUTPase:StlNT 晶体结构进行叠加，运用 VMD 创建每个残基的均方根偏差（RMSD）图。

（八）肽抑制剂设计

依据之前 HDX - MS 分析确定的 Y98 - Y113 序列段，设计基于 Stl 的肽抑制剂，并利用PepCalc.com评估其溶解性，通过 PEP - FOLD 3 预测 95 - DKMYSYVNKAYYNDGDIYYSSYD - 117 肽的结构。

（九）软件使用

运用 PyMOL 2.5.4 绘制晶体结构插图，用 PyMOL 的 align 命令进行晶体结构的叠加，使用 Octet Data Analysis 软件和 PowerPoint 分别绘制 BLI 图和示意图，其他图表由 OriginPro 2018 绘制，最后用 CorelDRAW 2020 整合单个图表和图像形成最终图形。

三、研究结果

（一）StlNT: 人 dUTPase 复合物的结构

通过 X 射线晶体学解析人 dUTPase 与折叠良好的 Stl N 末端片段（Stl - 1 - 159，StlNT）复合物的结构，分辨率达到 3.2 ?（PDB ID:8C8I）。该复合物在P_{1}_{1}_{1}_{1}_{1}空间群结晶，不对称单元包含一个 dUTPase 三聚体与三条 StlNT 链结合。整体结构与 φ11 噬菌体 dUTPase 和凡纳滨对虾 dUTPase（LvDUT）与 StlNT 的复合物相似。HDX - MS 测量表明，Stl 在结晶复合物中的主要结合表面是富含酪氨酸的 Y106 - D117 段，它与人类 dUTPase 活性位点的残基（保守基序 2、3、4）相互作用。与 φ11 噬菌体 dUTPase - StlNT 复合物相比，hDUT 和 LvDUT 与 Stl 的结合较弱，因为匹配位置的残基无法与 Stl 相互作用，这也解释了为何 φ11 噬菌体 dUTPase 能被 Stl 完全抑制，而人 dUTPase 和虾 dUTPase 在过量 Stl 存在时仍保留显著活性。此外，另一篇已发表的人 dUTPase 与 StlNT 复合物的晶体结构（PDB ID: 7PWJ）也证实了本研究的发现。

（二）基于结构设计具有潜在增强人 dUTPase 抑制能力的 Stl 点突变体

为增强 Stl 对 hDUT 的抑制作用，基于晶体结构针对 hDUT - StlNT 复合物的主要相互作用表面设计点突变体，期望增加两种蛋白质之间的相互作用。例如，预测将 Stl - Y106 替换为带正电侧链的残基可能与人类 dUTPase 基序 3 中的 D104 相互作用；将 Stl - S114 替换为带负电侧链的残基可能与 K91 相互作用；将 Y116 突变为精氨酸，可能增强与 hDUT 中 D127 的相互作用。通过 AlphaFold 建模分析，大多数模型显示出与预期相似的相互作用，但针对 Stl S114 残基的突变（S114E、S114D）导致 hDUT K91 残基的侧链与突变后 Stl 残基的主链形成氢键。热荧光分析显示，大多数突变体与野生型 Stl 稳定性相似，除了 S114D 和 S114E 突变体稳定性降低。酶活性测量表明，这六个突变体中没有一个比野生型 Stl 蛋白具有更好的抑制潜力。推测可能是新引入残基的柔性极性侧链可稳定在多种构象中，其取向与预测不符，导致突变后的 Stl 残基无法形成新的氢键与人类 dUTPase 结合。

（三）设计具有潜在增强人 dUTPase 抑制能力的 Stl 二聚体界面突变体

先前研究表明 Stl 二聚化会干扰其对人 dUTPase 的结合和抑制，因此假设在二聚体界面进行突变干扰 Stl 寡聚化，可能增强其对人 dUTPase 的抑制作用。将二聚体界面残基突变为丙氨酸，构建了三个携带单点和双点突变的 Stl 构建体（Stl - E189A、Stl - I181A, I184A、Stl - L192A, F196A）。热稳定性分析显示，只有双突变体 Stl - I181A, I184A 导致二聚体蛋白显著不稳定。AlphaFold 模型表明，这些突变干扰了 Stl 的二聚化，使 C 末端区域在空间上分开。酶活性测量显示，这些旨在破坏 Stl 二聚化的突变也损害了蛋白质对人 dUTPase 的抑制潜力。例如，表现最佳的二聚体界面突变体 Stl - I181A, I184A 的最大抑制效率约为 30%，其表观抑制常数（）为（2.3 + 1.8）nM，与野生型 Stl 对 hDUT 的结合强度相似，但突变后抑制效力降低，说明 Stl 的 C 末端段对抑制人 dUTPase 有贡献。

（四）Stl 抑制剂蛋白截短衍生物对人 dUTPase 的抑制作用

测试去除全长 Stl 的 C 末端二聚化结构域对其抑制人 dUTPase 能力的影响，研究发现 StlNT 对人 dUTPase 的最大抑制作用仅约为 50%，其对 hDUT 的表观抑制常数（）大于全长 Stl 蛋白（）。BLI 实验表明，StlNT 和全长 Stl 蛋白的结合动力学和强度相似，推测剩余活性是由于抑制剂结合相对较慢以及底物浓度较高，底物有效竞争活性位点，尽管抑制剂亲和力高，但结合慢使其无法有效阻止 dUTP 结合和快速催化。同时，测试 StlCT（残基 175 - 267）与人 dUTPase 的结合，未检测到二者结合，说明 Stl 的 C 末端部分不参与抑制剂与人 dUTPase 的结合，但在抑制酶活性中起重要作用。此外，测试基于 Stl 的肽 95 - DKMYSYVNKAYYNDGDIYYSSYD - 117 对人 dUTPase 酶活性的影响，发现即使在八倍摩尔过量的情况下，其最大抑制效果仅为 30%，明显低于全长 Stl 蛋白的 70% 抑制率。通过预测肽的结构，发现其与 hDUT 相互作用时可能采用更灵活的构象，且由于肽段较小，无法有效取代酶 C 末端包含保守基序 5 的臂，导致在活性位点结合时与 dUTP 底物的竞争较弱。

四、研究结论与讨论

本研究通过多种实验方法，深入探究了 Stl 蛋白对人 dUTPase 的抑制作用。研究发现，基于理性诱变设计的六种 Stl 点突变体，未能增强对 hDUT 的抑制效果，可能是由于引入的极性侧链灵活性高，预测的氢键未形成。由残基 95 - 117 组成的肽段以及 C 末端截短的 StlNT 对人 dUTPase 的抑制作用均弱于全长 Stl 蛋白，肽段抑制作用弱可能是因其构象灵活性增加，而 StlNT 抑制作用弱并非由于结合力弱，而是其他因素导致。StlCT 虽不直接参与与 hDUT 的结合，但在抑制酶活性方面具有重要作用，推测其通过空间位阻等效应发挥作用。

dUTPase 酶的催化反应涉及酶 C 末端灵活的第五个保守基序的复杂构象变化，该基序在催化过程中对活性位点的关闭和底物的固定起着关键作用。研究认为，dUTPase 基序 5 的灵活性、抑制蛋白的结合强度以及空间位阻能力共同决定了 Stl 变体对特定 dUTPase 酶的抑制程度，抑制作用是两种蛋白质之间微妙相互作用的结果。

该研究的重要意义在于，首次详细解析了人 dUTPase 与 StlNT 复合物的晶体结构，为深入理解二者相互作用机制提供了结构基础。同时，系统地研究了不同 Stl 突变体和截短衍生物对人 dUTPase 抑制作用的影响，明确了 Stl 蛋白不同区域在抑制过程中的作用，为后续设计更有效的人 dUTPase 抑制剂提供了宝贵经验。此外，研究结果还为进一步探究 dUTPase 酶的生理功能以及开发针对相关疾病（如癌症、病原微生物感染等）的治疗药物提供了理论依据，有助于推动基于 dUTPase 靶点的药物研发进程。未来，可能需要采用更高通量、定向进化或基于人工智能的方法，来寻找对特定 dUTPase 具有更强抑制效力的 Stl 突变体，为相关领域的研究和应用开辟新的方向。