巨孢子虫细胞能够在致命剂量的抗生素和化学压力下存活

巨芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，产生具有短暂记忆的启动细胞，其流行率在生长后期上升，并有助于增加抗生素持久性。

　　

探究革兰氏阳性菌应对抗生素及化学压力的独特生存策略 —— 对《Priestia megaterium cells are primed for surviving lethal doses of antibiotics and chemical stress》的解读

美国南达科他州立大学（South Dakota State University）生物学与微生物学系的 Manisha Guha、电气与计算机工程系的 Abhyudai Singh 以及化学与生物化学系的 Nicholas C. Butzin 在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Priestia megaterium cells are primed for surviving lethal doses of antibiotics and chemical stress” 的论文。这一研究成果为理解细菌对抗生素的耐受性机制提供了新视角，对开发新型抗菌策略、应对日益严峻的抗生素耐药性问题具有重要意义。

一、研究背景

抗生素耐药性感染在全球范围内导致大量死亡，每年有数百万人因此丧生。据美国疾病控制与预防中心（CDC）数据，美国每年有超过 280 万例抗生素耐药性感染病例，死亡人数超 3.5 万。且全球范围内，抗生素耐药菌造成的死亡人数预计到 2050 年将达到每年 1000 万，超过癌症目前的死亡人数。抗生素耐药性的加剧对人类健康构成了巨大威胁，因此深入研究细菌对抗生素的生存机制至关重要。

在细菌应对抗生素的过程中，抗生素持久性是导致复发性感染的关键因素。持久性细菌并非天生对抗生素耐药，而是能通过进入非分裂状态抵御抗生素的作用。这种耐受性常常导致抗生素使用时间延长，增加了耐药菌株产生的可能性。此前，人们普遍认为克隆细菌培养物会表现出相同的行为，但现在越来越多的研究表明，同基因细菌群体内存在显著的异质性。在细菌生长的对数期，即使在实验室严格控制的条件下以及自然环境中，细菌也会表现出内在的变异性，这种变异性源于基因表达的差异，在转录或翻译水平上导致了表型的异质性。细菌的持久性就是一种典型的 “风险对冲” 策略，在正常生长条件下，一小部分细胞会进入分裂停滞状态或准备转变为持久性细胞，当暴露于抗生素时，这些细胞能够存活下来，在压力解除后又能恢复分裂，这一过程使得细菌感染在治疗后容易复发，增加了治疗的难度。

虽然早在 1944 年就发现了细菌的持久性现象，但持久性细胞形成的机制仍存在争议。此前研究已在革兰氏阴性菌大肠杆菌中发现了 “预适应细胞”（primed cells），这类细胞能在压力到来前就做好成为持久性细胞的准备。本研究旨在探究预适应细胞是否仅存在于大肠杆菌中，以及它们与抗生素压力的特定关系，因此选择了与大肠杆菌亲缘关系较远的革兰氏阳性菌 Priestia megaterium（以前称为 Bacillus megaterium）进行研究，这有助于揭示细菌应激反应机制，为开发针对持久性细胞的新型药物以及有效治疗慢性复发性感染提供理论依据。

二、研究材料与方法

（一）实验菌株与培养条件

研究使用了 Priestia megaterium（原 Bacillus megaterium）ATCC 14581 和 Bacillus subtilis strain 1A1 168 两种菌株。细菌培养采用 Miller’s modification Lennox lysogeny broth（LB）液体培养基或 LB 固体培养基，培养温度为 37°C，振荡速度为 250 或 300 rpm。使用 Minimal Media B（MMB）进行缓冲稀释。

（二）关键技术与实验方法

1. 改良的 Luria–Delbrück 波动测试（FT）：为了研究细胞状态转变的动态过程，采用了改良的 Luria–Delbrück 波动测试。经典的 Luria–Delbrück 波动测试证明了与生存相关的基因突变是随机产生的，而非对选择压力的直接响应。本研究对其进行改良，用于研究在抗生素处理前细菌群体中预适应细胞的短暂存在。实验中，将细菌培养物稀释到单菌落水平，在 96 孔板中培养，随后用抗生素处理，通过比较不同克隆群体中持久性细胞的数量差异，判断预适应细胞的存在。
2. 噪声控制（NC）实验：通过测量整个细菌群体中持久性细胞百分比的变化来进行噪声控制实验。将对数期的细菌培养物均匀分配到 96 孔板的多个孔中，用抗生素处理后，计算每个孔中持久性细胞的百分比，以此评估群体水平上持久性细胞的变化情况。
3. 记忆测试：为了探究预适应细胞是否具有记忆以及这种记忆是否会传递给后代，进行了记忆测试。将对数期的细菌培养物稀释到单菌落水平，培养至对数期后，将其分为两个 96 孔板，进行不同倍数的稀释（1:2、1:10、1:100、1:500），然后同时对两个板进行波动测试，比较相应孔中持久性细胞的水平，判断记忆的存在及持续代数。
4. 其他实验：还进行了生长曲线、死亡曲线测定，抗生素抗性检测，孢子检测，氟化物处理实验以及最小抑菌浓度（MIC）测定等实验，以全面研究细菌的生长特性、对抗生素和化学压力的耐受性以及细胞状态的相关变化。

三、研究结果

（一）P. megaterium 培养物中存在 “预适应细胞”

通过比较噪声控制（NC）实验和波动测试（FT）中持久性细胞的数量，发现 FT 实验中 P. megaterium 经环丙沙星（Cip）处理后的持久性变化高达约 60 倍，而 NC 实验仅约 2 倍。这一显著差异表明，细菌群体中存在部分细胞已预先准备好成为持久性细胞，即 “预适应细胞”。进一步实验排除了突变导致高持久性的可能性，确认了预适应细胞的存在，且这些细胞并非针对特定抗生素产生，使用不同类别的抗生素（如针对 DNA 促旋酶的环丙沙星）及在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均发现了预适应细胞，说明这是一种广泛存在的现象。

（二）预适应细胞具有短期记忆

通过记忆测试发现，当细胞以 1:2 和 1:10 稀释时，两个重复板中相应孔的持久性细胞水平呈现强相关性，表明预适应细胞具有记忆，且这种记忆可传递给后代。随着稀释倍数增加到 1:100，相关性减弱，1:500 时相关性消失，说明记忆是短暂的，大约持续 9 代。由于持久性细胞与抗生素敏感细胞在基因上相同，因此推断这种记忆是表观遗传的，即通过非遗传的方式将细胞的表型特征传递给后代。

（三）持久性细胞数量与生长时间的关系

研究旨在确定细菌培养物的细胞密度是否会影响预适应细胞或持久性细胞的数量。通过对 36 个克隆群体进行波动测试，结果显示细胞密度（通过或 CFU/ml 测量）与持久性细胞水平之间没有相关性。此外，分析单个孔的生长速率和滞后期与持久性细胞数量的关系，也未发现相关性。这表明慢生长并不会导致预适应细胞或持久性细胞水平的明显变化，大多数持久性细胞并非来自慢生长细胞，即使慢生长细胞对高持久性细胞水平有贡献，其在总体持久性细胞群体中也可能只占一小部分。

（四）预适应细胞数量在对数期后增加

先前研究表明，一些细菌在指数生长后期持久性水平会上升。本研究发现，P. megaterium 在过渡阶段（约 1.0）和稳定期（约 1.5）的平均持久性细胞百分比相比对数期分别增加了约 2 倍和 4 倍。虽然在对数期后持久性细胞百分比增加，但 NC 和 FT 实验中的变异系数（CV）和倍数变化（最高和最低持久性细胞百分比之间的差异）与对数期相似，仅均值和中位数发生变化。这表明预适应细胞数量在后期生长阶段增加，进而导致持久性细胞数量增加，同时也证明了传统认为的 I 型和 II 型持久性细胞可能并不存在明显差异，它们的形成可能都受预适应细胞数量的调控。

（五）预适应细胞对多种压力具有耐受性

将 P. megaterium 暴露于致死浓度的氟化物中，结果显示，在氟化物处理下，NC 和 FT 实验中持久性细胞水平的倍数变化分别约为 3 倍和 78 倍，这表明预适应细胞能够应对多种压力，不仅仅是抗生素压力。同时，在稳定期，经氟化物处理后，预适应细胞数量相比对数期更高，进一步证明了在面对非抗生素化学压力时，预适应细胞数量增加导致持久性细胞增多的现象并非局限于抗生素暴露。

（六）其他革兰氏阳性菌中也存在预适应细胞

对另一种革兰氏阳性菌 Bacillus subtilis 进行致死剂量的环丙沙星（4.7 μg/mL）测试，发现其也存在类似的预适应现象。结合之前在大肠杆菌（革兰氏阴性菌）中的研究，表明预适应细胞在多种细菌物种中普遍存在。

四、研究结论与讨论

本研究证明了革兰氏阳性菌 P. megaterium 中存在预适应细胞，这些细胞能够增加抗生素持久性细胞的数量。预适应细胞具有短期记忆，通过表观遗传传递给后代，在细菌生长的后期阶段，预适应细胞数量增加，导致持久性细胞增多。此外，预适应细胞不仅能应对抗生素压力，还能对非抗生素化学压力（如氟化物）产生耐受性，且在其他革兰氏阳性菌中也存在预适应现象，说明这是一种广泛存在于细菌中的生存策略。

该研究成果具有重要的意义。在理论层面，揭示了细菌应对压力的新机制，挑战了传统关于持久性细胞类型的认知，表明持久性细胞的形成可能主要受预适应细胞数量的调控，而非不同的生长阶段或机制。在应用方面，为开发新型抗菌药物提供了潜在靶点。由于预适应细胞是持久性细胞的前体，针对预适应细胞形成机制的研究，有望开发出阻止持久性细胞形成的药物，从而降低抗生素耐药性的产生，为解决日益严重的抗生素耐药性问题提供新的思路和方法。

然而，本研究也存在一定的局限性。研究未涉及活的但不可培养细胞（VBNCs）的详细情况，尽管实验表明 VBNCs 对结果无明显干扰，但仍未全面探究其影响。对于预适应细胞、持久性细胞和敏感细胞之间的转换机制了解甚少，例如细胞从持久性状态恢复后是否通过预适应细胞中间体转变为敏感细胞，目前尚无证据支持但存在这种可能性。此外，虽然排除了可逆染色体重排（RCRs）单独作为预适应细胞形成及记忆机制的可能性，但不能完全排除其与表观遗传修饰共同作用的可能。未来的研究可以进一步深入探究这些未知领域，完善对细菌应激反应机制的理解，为抗菌药物的研发提供更坚实的理论基础。