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非洲猪瘟病毒（ASFV）严重威胁养猪业，目前缺乏有效防治手段。研究人员开展了 ASFV 蛋白免疫逃逸机制的研究，发现 ASFV 的 DP71L 可抑制 STING 介导的抗病毒反应，干扰干扰素生成等。这为理解 ASFV 致病机制和开发减毒活疫苗提供了指导。
非洲猪瘟，对于养猪业而言，就像一场可怕的噩梦。非洲猪瘟病毒（ASFV）所引发的非洲猪瘟，致死率近乎 100%，一旦爆发，会给全球的猪肉供应和粮食安全带来沉重打击，让养殖户们遭受巨大的经济损失。然而，当前针对 ASFV，既没有有效的商业疫苗，也缺乏特效药物。
众多研究表明，ASFV 对干扰素（IFN）较为敏感，且在感染过程中，会通过多种策略逃避宿主的 IFN 反应，其中一些 ASFV 编码的蛋白已被证实是 IFN-I 的拮抗剂。不过，关于 ASFV 蛋白的免疫逃逸机制，仍有许多未知之处，亟待探索。
在这样的背景下，韩国忠南国立大学兽医学院等机构的研究人员，针对 ASFV 的免疫逃逸机制展开了深入研究。他们将目光聚焦在 ASFV 的 DP71L 蛋白上，最终发现 DP71L 能够抑制 STING 介导的抗病毒反应，这一成果发表在《Veterinary Research》杂志上，为深入理解 ASFV 的致病机制和开发减毒活疫苗提供了重要的理论依据。
研究人员在此次研究中，运用了多种关键技术方法。首先是细胞培养技术，使用了多种细胞系，如猪肾上皮细胞（PK-15）、HeLa 细胞等；其次，通过定量实时 PCR（qRT-PCR）技术来检测基因的表达水平；免疫沉淀、免疫印迹分析则用于研究蛋白之间的相互作用和蛋白的表达及磷酸化情况 。
下面来具体看看研究结果：
- DP71L 负向调节抗病毒免疫反应：研究人员通过双荧光素酶报告基因检测筛选 ASFV 基因库，发现 DP71L 能抑制 STING 介导的 IFN-β 荧光素酶活性。转染 DP71L 表达质粒的 PK-15 细胞，在感染 GFP 标记的 DNA 病毒后，相较于对照细胞，表现出更高的 GFP 吸光度和病毒滴度，同时细胞培养上清中 IFN-β 和 IL-6 的分泌水平更低。在 MA104、3D4/21 和 PIB 等稳定表达 DP71L 的细胞中，也得到了类似结果。这表明 DP71L 在巨噬细胞和上皮细胞系中，能够作为 IFN-I 和促炎细胞因子产生的负调节因子，同时增强病毒 DNA 的复制。
- DP71L 抑制 IFN 通路信号传导和抗病毒基因转录：在 DP71L 转染的 PK-15 细胞和稳定表达 DP71L 的 3D4/21 细胞感染 ADV-GFP 后，研究人员通过免疫印迹分析发现，TBK1、STAT1、IRF3、p65 和 IκBα 的磷酸化水平显著低于对照细胞。同时，利用 qRT-PCR 检测发现，IFN-β 和其他干扰素刺激基因（ISGs）的 mRNA 表达水平也明显降低。这说明 ASFV 的 DP71L 能够负向调节 IFN-I 信号通路，抑制抗病毒基因的表达。
- DP71L 直接与 STING 相互作用：一系列双荧光素酶报告基因检测显示，DP71L 能够剂量依赖性地抑制由 Poly (dA:dT)、cGAS、cGAMP 和 STING 介导的 IFN-β 启动子活性，而对 TBK1、IRF3 或 IKKε 介导的 IFN-β 启动子活性无显著影响，表明 DP71L 特异性靶向 TBK1 上游分子。通过 GST pull-down 实验结合质谱分析、免疫沉淀实验、体外结合实验以及共聚焦显微镜观察等方法，证实了 DP71L 与 STING 存在相互作用，且 DP71L 的保守 PP1 结构域与 STING 特异性结合。
- DP71L 抑制 STING-TBK1 相互作用：研究人员构建了表达 STING 不同结构域的质粒，通过免疫沉淀实验发现 DP71L 特异性地与 STING 的 C 末端尾（CTT）相互作用。竞争实验表明，DP71L 能够有效抑制 STING 与 TBK1 的相互作用，且这种抑制作用呈剂量依赖性。SDD-AGE 实验和共聚焦显微镜观察结果显示，DP71L 不影响 STING 的聚合，但会损害 STING/TBK1 斑点的形成。这说明 DP71L 选择性地靶向 STING 的 CTT，抑制了 STING 与 TBK1 的相互作用。
- STING 的 P371、L374 和 R375 位点突变消除其与 DP71L 的相互作用：研究发现，增加 DP71L 的剂量会显著降低磷酸化 STING（pSTING）的水平，减少 STING 与 IRF3 的相互作用。免疫沉淀实验表明，DP71L 通过 TBK1 结合位点（包括 P371、L374 和 R375 残基）与 STING 相互作用，而 STING 的磷酸化位点 S366 不参与与 DP71L 的相互作用。这表明 DP71L 与 STING CTT 的结合，特异性地抑制了 STING 与 TBK1 的相互作用，进而抑制了 TBK1 的自磷酸化、STING 的磷酸化以及 pSTING 与 IRF3 的后续结合。
- DP71L 敲低促进 ASFV 感染细胞中的抗病毒基因水平：在 STING 敲除（STING KO）的 HeLa 细胞中表达 DP71L，感染 ADV-GFP 和 HSV-GFP 后，与 STING 野生型（STING WT）细胞相比，STING KO 细胞的 GFP 吸光度和病毒滴度更高，且细胞培养上清中 IFN-β 和 IL-6 的分泌水平更低，而对照和 DP71L 转染的 STING KO 细胞之间无显著差异，这表明 STING 是 DP71L 发挥抗病毒作用的关键。对感染 ASFV 的原代猪肺泡巨噬细胞（primary PAM）进行研究发现，DP71L 是 ASFV 的晚期转录基因。利用 DP71L 特异性 siRNA 敲低 DP71L 后，ASFV 感染的 primary PAM 细胞中抗病毒基因的表达水平显著升高。
综合研究结论和讨论部分的内容，此次研究揭示了一种新的分子机制，即 ASFV 的 DP71L 通过与 STING 的 CTT 区域相互作用，破坏了 STING 介导的包括 TBK1 和 IRF3 在内的抗病毒信号的下游传递，从而抑制宿主的早期免疫反应。这一发现拓展了人们对 ASFV 致病机制的理解，为研究病毒的减毒机制以及开发 ASFV 疫苗提供了新的思路和方向。
