牛 Coronin-1A 的 WD 重复结构域：调控结核分枝杆菌存活的关键靶点及潜在抗结核育种新策略

为探究牛 Coronin-1A（bCoronin-1A）在结核分枝杆菌（M.tb）感染中的作用，西北农林科技大学研究人员开展相关研究。结果表明，bCoronin-1A 的 WD 重复结构域与 M.tb 的 LpdC 互作，抑制钙信号介导的吞噬体 - 溶酶体融合，促进 M.tb 存活。该研究为培育抗结核奶牛提供新思路。

　　牛结核病是一种慢性消耗性人畜共患病，给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失，同时也严重威胁着公共卫生安全。在这场人 “菌” 大战中，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）可谓是个狡猾的 “敌人”，它进化出了多种逃避宿主免疫反应的机制，其中抑制吞噬体 - 溶酶体融合就是其关键的 “保命绝招” ，使得它能够在巨噬细胞内逍遥自在地存活，从而持续作恶。而 Coronin-1A 作为宿主细胞骨架相关蛋白，在这个过程中扮演着重要角色，但牛 Coronin-1A（bCoronin-1A）在 M.tb 感染中的具体作用却一直是个未解之谜。为了揭开这个谜团，西北农林科技大学的研究人员勇挑重担，开展了一系列深入研究，相关成果发表在《Veterinary Research》上。

研究人员主要采用了细胞实验技术。细胞培养及转染技术，培养了胚胎牛肺（EBL）细胞、小鼠 RAW264.7 细胞和人 293T 细胞，并将质粒导入细胞；进行了分枝杆菌培养和感染实验，用 H37Ra 和卡介苗（BCG）菌株感染细胞；运用免疫荧光（IF）测定、蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫共沉淀（Co-IP）等技术，检测蛋白表达、定位及相互作用；通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析基因表达；还利用钙测量技术检测细胞内钙离子浓度。

研究结果如下：

1. bCoronin-1A 在 M.tb 感染后上调并促进分枝杆菌存活：研究人员通过序列比对和结构分析发现，bCoronin-1A 与人类和小鼠的 Coronin-1A 高度同源。感染实验表明，H37Ra 或 BCG 感染 EBL 细胞后，bCoronin-1A 的 mRNA 和蛋白水平显著增加。免疫荧光分析显示，感染 H37Ra 后，bCoronin-1A 不仅在细胞皮层定位，还围绕在分枝杆菌周围。菌落形成单位（CFU）实验和细胞活力检测表明，bCoronin-1A 促进了 M.tb 的存活，同时降低了宿主细胞活力。
2. bCoronin-1A 通过阻断吞噬体 - 溶酶体融合促进 M.tb 逃避溶酶体降解：免疫荧光实验发现，过表达 bCoronin-1A 不影响 M.tb 与细胞的结合。但进一步研究表明，过表达 bCoronin-1A 的细胞中，H37Ra 与溶酶体相关膜蛋白 - 1（LAMP1）共定位的比例显著降低，说明 M.tb 大多滞留在吞噬体中，无法被运输到溶酶体。此外，从过表达 bCoronin-1A 的细胞中分离的溶酶体中，FITC 标记的 H37Ra 含量减少，吞噬体中 LAMP1 的表达水平也较低，而溶酶体酸化和相关基因的表达没有明显差异，这些都表明 bCoronin-1A 阻碍了吞噬体 - 溶酶体融合。
3. bCoronin-1A 的 WD 重复结构域对抑制含 M.tb 的吞噬体 - 溶酶体融合至关重要：研究人员发现，M.tb 的 LpdC 与 bCoronin-1A 相互作用，而这种相互作用依赖于 bCoronin-1A 的 WD 重复结构域。当 WD 重复结构域缺失时，LpdC 与 bCoronin-1A 的相互作用消失。过表达缺失 WD 重复结构域的 bCoronin-1A（ΔW），会增加 M.tb 与溶酶体的共定位，提高 LAMP1 的表达，增加溶酶体中 FITC 标记的 M.tb 含量，同时降低 M.tb 的存活率，这表明 WD 重复结构域是 bCoronin-1A 与 LpdC 相互作用的关键结构，有助于 M.tb 逃避溶酶体的清除。
4. bCoronin-1A 的单个 WD 单元可与 M.tb 的 LpdC 相互作用：由于 WD 重复结构域由七个 WD 单元组成，研究人员进一步截断该结构域，发现单个 WD 单元就能与 LpdC 相互作用。过表达含有单个或两个 WD 单元的 bCoronin-1A，会使 M.tb 与溶酶体的共定位略有减少，CFU 实验也显示 M.tb 的细胞内增殖略有增加，说明单个 WD 单元有助于 bCoronin-1A 与 LpdC 的相互作用，使 M.tb 逃避溶酶体的清除。
5. WD 重复结构域介导细胞内 Ca²⁺减少并抑制 CaMKII 的激活：研究人员利用荧光钙探针 fluo-4AM 检测发现，过表达 bCoronin-1A 的细胞内 Ca²⁺水平显著降低，而用 Ca²⁺离子载体（ionomycin）处理后，Ca²⁺水平升高。Western blot 检测发现，过表达 bCoronin-1A 的细胞中，CaM 依赖的蛋白激酶 II（CaMKII）及其激活形式的蛋白水平较低，用 ionomycin 处理后，其水平回升。免疫荧光实验表明，ionomycin 处理后，H37Ra 与溶酶体的共定位百分比与对照组相当。这些结果表明，WD 重复结构域参与降低细胞内 Ca²⁺水平，抑制 CaMKII 的激活，进而阻碍吞噬体 - 溶酶体融合。

研究结论和讨论部分指出，本研究首次证实 bCoronin-1A 通过 WD 重复结构域与 M.tb 的 LpdC 相互作用，使 bCoronin-1A 滞留在吞噬体上，降低细胞内 Ca²⁺水平，抑制吞噬体 - 溶酶体融合，从而促进 M.tb 的存活。这表明 bCoronin-1A 可能是增强牛对 M.tb 抗性的潜在靶点，为培育抗结核奶牛提供了新的思路和理论依据。但 bCoronin-1A 与 CaM 的关系以及 M.tb 感染导致 bCoronin-1A 上调的原因仍有待进一步探索，未来有望通过基因编辑技术对关键调控区域进行修饰，提高牛对结核病的抵抗力，为奶牛养殖业的健康发展保驾护航。