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本文全面综述了 CRISPR/Cas 基因组编辑技术在棉花育种中的应用。该技术可精准操控棉花基因组，在纤维品质、油分改良、抗逆性等方面成果显著。但棉花基因组复杂，应用中面临脱靶、转化效率低等挑战。文章还对其未来发展进行了展望，为棉花育种研究提供重要参考。
CRISPR/Cas 基因组编辑技术在棉花精准育种中的作用机制、研究进展及应用前景
棉花（Gossypium hirsutum L.）作为全球最重要的农作物之一，对纺织业发展和数百万棉农生计意义重大。随着需求的持续增长，提升棉花产量成为当务之急。基因组编辑技术，尤其是成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白（Cas）工具的出现，为棉花性状改良带来了新契机，与其他基因工程手段相比，它能更精准、高效地对棉花基因组进行调控。
1. 棉花的重要性及基因组编辑需求
棉花不仅是天然纤维的重要来源，其种子还可用于生产食用油、动物饲料及工业产品。棉花基因组具有多种倍性类型且结构复杂，栽培的商业棉花多为异源四倍体（AD），陆地棉（Gossypium hirsutum）基因组大小达 2.5 Gb。棉花纤维主要由 87%-90% 的纤维素构成，这使其具备诸多优良特性，如能承受高温、适应多种染料且耐洗涤。同时，棉花种子富含蛋白质和油脂，在食品和纺织行业发挥着重要作用。
然而，棉花种植面临诸多挑战。在种植环境方面，棉花适宜种植在北纬 30° 至南纬 30° 之间，气候条件对纤维品质和产量影响显著。而且，多种昆虫会侵害棉花植株，化学农药虽能防治虫害，但因生态问题需谨慎使用。随着基因组测序技术的发展，棉花功能基因组研究取得进展，对精准编辑棉花基因的需求也日益迫切。
2. CRISPR/Cas 技术在棉花基因组编辑中的应用
CRISPR/Cas9 系统由 Cas9 核酸酶和单链引导 RNA（sgRNA）组成，能实现对特定基因的精准编辑，在棉花基因组编辑中应用广泛。
在棉花基因组编辑中，确定靶向基因并验证编辑效率至关重要。棉花复杂的异源四倍体基因组包含 A 和 D 亚基因组，许多基因存在多个拷贝且序列高度同源，这增加了基因编辑的难度。例如，Li 等人（2017）利用 CRISPR/Cas9 系统敲除GhMYB25-like A 和GhMYB25-like D 基因，突变频率分别高达 100% 和 98.8% ，且未发现脱靶突变。Gao 等人（2017）针对GhEF1和GhPDS基因进行编辑，Chen 等人（2017）对GhCLA1和GhVP基因开展研究，均验证了 CRISPR/Cas9 系统在棉花基因组编辑中的有效性。
CRISPR/Cas 技术在棉花多种性状改良中发挥着关键作用。在纤维品质改良方面，研究发现多个与纤维长度相关的基因，如GhAlaRP和GhIm基因。Zhu 等人（2018）利用 CRISPR/Cas9 系统对GhAlaRP基因进行编辑，证实该基因通过调节细胞扩张和细胞壁生物合成影响纤维伸长。Zhang 等人（2021a）研究发现GhIm基因对线粒体nad7 mRNA 的剪接至关重要，影响纤维发育和品质。
在油分改良方面，棉花是世界第三大食用油籽作物。Shang 等人（2017）通过生物信息学分析和实验验证，对棉花SAD基因家族进行研究，为棉花籽油品质改良提供了潜在靶点。Chen 等人（2021）利用 CRISPR/Cas9 技术敲除GhFAD2基因，显著提高了棉花籽油中油酸含量，使其更适合工业应用。
面对生物和非生物胁迫，CRISPR/Cas 技术也展现出巨大潜力。棉花易受多种病虫害侵袭，如棉花卷叶病（CLCuD）和黄萎病。Zhang 等人（2018b）利用 CRISPR/Cas9 技术编辑Gh14-3-3d基因，增强了棉花对黄萎病的抗性。Binyameen 等人（2021）和 Mubarik 等人（2021）通过多重 CRISPR/Cas9 技术靶向棉花卷叶病毒（CLCuV）基因组，有效控制了该病毒。
此外，CRISPR/Cas 技术还可用于去除棉花中的抗营养化合物。例如，Li 等人（2021a）利用温度敏感的 CRISPR/LbCpf1（LbCas12a）系统，成功培育出不含棉酚的棉花植株，提高了棉籽产品在食品和饲料行业的应用潜力。
3. CRISPR/Cas 技术在棉花应用中的挑战
尽管 CRISPR/Cas 技术在棉花基因组编辑中取得了一定成果，但仍面临诸多挑战。
棉花复杂的多倍体基因组带来了诸多问题。基因冗余使得编辑特定基因时难以确保所有拷贝都被有效改变，从而影响性状表现。大量的同源和旁系同源序列增加了 sgRNA 设计的难度，容易导致脱靶效应。而且，棉花基因组中存在高度重复的 DNA 序列，进一步加大了 CRISPR/Cas 组件设计和递送的复杂性。
脱靶效应是 CRISPR/Cas 技术应用中的一个重要问题。即使采用先进技术，在复杂的棉花基因组中，仍难以避免脱靶突变的发生。这些意外突变可能影响其他性状或导致遗传不稳定。
棉花的遗传转化效率较低，目前仅少数棉花基因型可通过传统农杆菌介导的转化方法进行转化，多数优良品种再生困难，这限制了转基因和基因组编辑技术在棉花性状改良中的应用。而且，棉花细胞在遗传修饰后再生为完整植株的难度较大，增加了编辑植株培育的时间和资源成本。
在基因表达调控方面，四倍体生物的基因表达调控机制复杂，编辑单个基因拷贝可能无法产生预期表型，甚至对整体基因调控产生不可预测的影响。
此外，CRISPR 编辑的棉花植株还面临监管障碍、公众认知和伦理问题。不同地区对基因编辑生物的监管政策不同，可能影响其推广应用。公众对转基因生物和基因编辑技术存在担忧，这也可能阻碍 CRISPR 编辑棉花的接受和应用。同时，棉花生产涉及多种复杂性状，改变单个基因往往难以实现理想的育种目标，需要进行多个基因编辑和复杂的基因调控。而且，CRISPR 技术的知识产权问题也可能限制其在棉花研究中的应用。
4. 未来展望
尽管 CRISPR/Cas 技术在棉花基因组编辑中面临挑战，但前景依然广阔。随着技术的不断发展，更高效、快速的基因编辑方法将不断涌现，如病毒介导的递送、核糖核蛋白（RNPs）复合物递送和纳米颗粒介导的递送等，这些方法将提高基因编辑效率，减少脱靶效应。未来的研究应致力于进一步优化 CRISPR/Cas 技术，提高编辑的精准性和效率，降低脱靶效应。同时，结合其他新兴技术，如人工智能辅助的 sgRNA 设计、单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）解析棉花体细胞胚胎发生和植株再生的调控机制等，有望推动棉花基因组编辑技术的发展。此外，加强对 CRISPR 编辑棉花的安全性评估和监管，提高公众对基因编辑技术的认知和接受度，也将为 CRISPR/Cas 技术在棉花精准育种中的广泛应用奠定基础。
