USP39 相分离驱动肺腺癌进展：潜在的肺癌治疗新靶点

为探究去泛素化酶（DUBs）在核仁的相分离及与肺癌发展的关联，大连医科大学等机构的研究人员开展了关于 USP39 的研究。结果表明 USP39 通过调节 GLI1 促进肺腺癌进展，抑制 USP39 可抑制肺癌生长，为肺癌治疗提供新策略。

　　在细胞的微观世界里，有一种奇妙的现象 —— 液 - 液相分离（Liquid - Liquid Phase Separation，LLPS）。它就像细胞内的 “建筑师”，利用多价或多个弱相互作用，搭建起由蛋白质和核酸组成的生物分子凝聚物，这些凝聚物形成了无膜细胞器，参与到细胞的各种生理过程中。然而，当这个 “建筑师” 失控时，就可能引发一系列疾病，癌症便是其中之一。

核仁，作为细胞内最大的无膜细胞器之一，也是由 LLPS 形成的。它在核糖体生物发生、基因组稳定性、细胞周期调控等方面发挥着关键作用，与癌症的发展有着千丝万缕的联系。而去泛素化酶（Deubiquitylating enzymes，DUBs），能够调节蛋白质的稳定性、基因表达等过程，一旦出现异常，就可能导致细胞的异常增殖和迁移，推动癌症的进展。因此，DUBs 成为了癌症治疗的新兴靶点。

尽管 LLPS 和 DUBs 在癌症研究中备受关注，但核仁相关的相分离 DUBs 及其对肿瘤发生的影响，仍存在许多未知。在这样的背景下，大连医科大学癌症干细胞研究所等机构的研究人员开展了深入研究，试图揭开其中的奥秘。他们的研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》杂志上，为肺癌的治疗提供了新的思路和潜在策略。

研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，通过免疫荧光（Immunofluorescence）、荧光漂白恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching，FRAP）等技术，分析蛋白质的相分离特性和定位；利用 Western blot、RT - PCR 等方法检测基因和蛋白质的表达水平。在动物实验方面，构建肿瘤异种移植模型，将肺癌细胞接种到裸鼠体内，观察肿瘤的生长情况。同时，还进行了转录组分析，筛选出受 USP39 调控的下游基因。

研究结果如下：

1. USP39 在核仁中形成相分离凝聚物：研究人员发现，在前期对 71 种 DUBs 的亚细胞定位研究中，USP39 呈现出核仁样分布，且其凝聚物可被 1,6 - 己二醇溶解，这表明 USP39 凝聚物具有 LLPS 特征。通过 PhaSepDB 数据库分析，确定了 USP39 的 1 - 103 位氨基酸残基区域为内在无序区域（Intrinsically Disordered Region，IDR），该区域是 LLPS 相关蛋白的结构特征。FRAP 实验显示，GFP - USP39 凝聚物在光漂白后 20 秒内荧光强度恢复到 70% 以上，证明了其流动性和动态性。此外，共聚焦显微镜观察发现，GFP - USP39 与核仁标志物 NPM1、RPA40 和 FBL 共定位，表明 USP39 通过相分离在核仁中形成液态凝聚物。
2. 1 - 103 位氨基酸残基的无序区域驱动 USP39 的 LLPS：为了明确 USP39 中负责 LLPS 的结构域，研究人员构建了 5 种 GFP 标记的 USP39 截断体。免疫荧光实验表明，包含 IDR 序列的 USP39 全长、USP39 - N (1 - 103)、USP39 - ΔC 和 USP39 - ΔUBP 在核仁中形成相分离凝聚物，而去除 IDR 的 USP39 - ΔN 和 USP39 - (184 - 565) 则在细胞中呈弥散分布。FRAP 分析显示，GFP - USP39 - N (1 - 103) 凝聚物在光漂白后约 18 秒内荧光信号快速恢复到近 70%。体外实验中，添加拥挤剂聚乙二醇（PEG）和 NaCl 模拟细胞环境，发现 GFP - USP39 - N (1 - 103) 能形成球形液滴，且液滴的大小和数量随 PEG 分子量和 NaCl 浓度的增加而增加，进一步证实了 1 - 103 位氨基酸残基的无序区域驱动 USP39 的 LLPS。
3. USP39 沉默抑制肺腺癌细胞的生长和迁移：由于在肺癌细胞中稳定敲低 USP39 存在困难，研究人员利用 Tet - on 诱导敲低系统构建了稳定的 A549 和 H1299 细胞系。MTT 和集落形成实验表明，多西环素诱导的 USP39 下调显著抑制了 A549 和 H1299 细胞的生长；Transwell 实验显示，细胞迁移能力也明显受到抑制。恢复 USP39 表达后，细胞的生长和迁移能力得到部分恢复。此外，研究人员还构建了表达不同 USP39 突变体的细胞系，发现 USP39 的 IDR 区域（1 - 103 位氨基酸残基）和 C 末端结构域（104 - 565 位氨基酸残基）共同促进肺癌的发展，缺失任何一个区域都会损害 USP39 在肺腺癌中的致癌活性。
4. USP39 敲低抑制 GLI1 表达：通过对 H1299 细胞进行转录组分析，研究人员筛选出 7 个受 USP39 调控的候选基因，包括 GLI1、TPPP3、IFITM1、LGALS1、EPS8L2、DDIT4 和 RRAS。RT - PCR 分析表明，除 IFITM1 和 RRAS 外，其他 5 个基因的 mRNA 水平在 USP39 敲低后下降，恢复 USP39 表达后回升。临床数据分析显示，GLI1 和 DDIT4 的高表达与患者预后不良相关，且 USP39 与 GLI1 的表达呈正相关。Western blot 实验进一步证实，USP39 敲低降低了 GLI1 的蛋白水平，而恢复 USP39 表达后，GLI1 水平回升。GLI1 启动子荧光素酶报告基因实验表明，USP39 全长以不依赖去泛素化酶活性的方式调节 GLI1 转录，而单独的 IDR 区域或去除 IDR 的突变体则不能有效调节 GLI1 转录。敲低 GLI1 可抑制由 USP39 过表达引起的细胞生长和迁移增加，但仍有部分细胞生长和迁移增加，说明 USP39 主要通过 GLI1 调节肺腺癌细胞的生长和迁移，但可能还有其他下游因子参与这些过程。
5. USP39 敲低有效抑制裸鼠体内异种移植瘤的生长：研究人员将 H1299 对照细胞、稳定转染 USP39 shRNA 的细胞以及稳定转染 USP39 shRNA 和拯救构建体的细胞分别皮下接种到裸鼠体内，构建肿瘤异种移植模型。多西环素诱导 USP39 敲低后，发现肿瘤生长明显受到抑制，恢复 USP39 表达后，肿瘤体积恢复到与对照组相似的水平。免疫组化分析显示，USP39 敲低导致肿瘤组织中 GLI1 染色显著减少，增殖标记物 Ki67 表达降低；恢复 USP39 表达后，GLI1 和 Ki67 的染色强度增加。Western blot 分析进一步证实了肿瘤组织中 GLI1 水平的变化。

研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了 USP39 的 LLPS 特性，其通过 IDR 序列介导在核仁中相分离，并通过上调 GLI1 发挥促癌作用。这为深入理解 USP39 在肺癌发生发展中的作用机制提供了新视角。同时，靶向 USP39 的 LLPS 可能成为肺癌治疗的潜在策略，未来可以探索针对 USP39 的 IDR 区域的小分子化合物或肽基抑制剂，干扰 USP39 凝聚物的聚集，从而抑制癌症的发展。此外，研究还发现除 GLI1 外，USP39 可能还通过调节其他基因参与肺癌的发生发展，这为后续研究提供了新的方向。总之，这项研究为肺癌的治疗和研究开辟了新的道路，具有重要的理论和临床意义。