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为探究斑马鱼胚胎发育过程中细胞外囊泡（EVs）的情况，研究人员从斑马鱼幼虫中分离 EVs 并进行表征分析。结果显示，在胚胎发育的 96 小时内，EVs 的数量、大小等发生显著变化，这表明其在斑马鱼器官发生中起重要作用，为相关研究提供新视角。
在生命的奇妙旅程中，胚胎发育一直是科学家们深入探索的神秘领域。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）作为细胞间通信的重要 “使者”，在细胞分化等过程中发挥着关键作用。它们就像微小的包裹，携带各种生物分子，在细胞之间传递信息。然而，尽管斑马鱼是广泛应用的脊椎动物模型，在研究人类疾病和发育生物学等方面贡献巨大，但对于斑马鱼胚胎发育过程中 EVs 的了解却十分有限。目前，关于斑马鱼胚胎发育过程中 EVs 的研究存在诸多空白，如不同发育阶段 EVs 的变化规律、其在器官形成中的具体作用机制等都有待揭示。这不仅限制了我们对斑马鱼胚胎发育的深入理解，也阻碍了相关疾病治疗研究的进展。为了填补这些知识空缺，来自德国埃尔兰根大学医院等多个机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》杂志上，为我们揭示了斑马鱼胚胎发育过程中 EVs 的奥秘，对深入理解胚胎发育机制以及相关疾病的研究具有重要意义。
研究人员采用了多种关键技术方法。在样本处理方面，收集不同受精后时间（24、48、72 和 96 小时，hpf）的野生型 AB 品系斑马鱼幼虫（zebrafish larvae，zfl），并进行匀浆处理。之后，利用差速离心法分离 EVs，这种方法能够有效富集不同类型的 EVs。在 EVs 的表征分析中，运用了流式细胞术（Flow cytometry）、负染色透射电子显微镜（Negative staining transmission electron microscopy，TEM）、纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis，NTA）以及蛋白质免疫印迹（Western Blotting，WB）等技术。这些技术从不同角度对 EVs 进行检测，为研究提供了全面的数据支持。
研究结果如下：
- 流式细胞术分析：通过流式细胞术对不同时间点的斑马鱼幼虫匀浆沉淀物进行检测，发现标记为大细胞外囊泡（large Extracellular Vesicles，lEVs）的事件中，89.4 - 99.8% 对 AxV - FITC 呈阳性，且该染色可被 EDTA 完全逆转。随着幼虫发育，AxV - FITC 阳性 lEVs 的比例有增加趋势，但未达到显著水平。同时，66.1 - 99.1% 的 lEVs 对 FM4 - 64 呈阳性，其阳性比例在 24 hpf 到 48 hpf 之间显著增加（p = 0.0421）。此外，67.5 - 94% 的 lEVs 对 Annexin V - FITC 和 FM4 - 64 双染呈阳性，在 72 hpf 内其比例有增加趋势，但不显著。AxV - FITC 阳性 lEVs 的平均荧光强度（MFI）在 72 hpf 和 96 hpf 时相比 24 hpf 显著降低（p = 0.0381，p = 0.0054），而 FM4 - 64 阳性 lEVs 的 MFI 则无明显变化。
- 纳米颗粒跟踪分析（NTA）：NTA 结果显示，在胚胎发育的前 96 hpf 内，小细胞外囊泡（small Extracellular Vesicles，sEVs）、lEVs 和总 EVs 的浓度逐渐增加，在 72 hpf 和 96 hpf 时相比 24 hpf 显著升高（sEVs：p = 0.0009，p = 0.0043；lEVs：p = 0.0021，p = 0.0089；所有 EVs：p = 0.0002，p = 0.0024），不过从 72 hpf 到 96 hpf 浓度有轻微下降，但不显著。将每毫升 sEVs、lEVs 和总 EVs 的数量与斑马鱼幼虫在相应发育时间点的长度进行关联分析，发现其数量随时间增加，在 72 hpf 和 96 hpf 时相对于 24 hpf 显著增加，同样在 72 hpf 到 96 hpf 有轻微下降。lEVs 的中位大小在 130 - 164 nm 之间，随时间保持不变；而 sEVs 的中位大小则从 109 nm 逐渐增加到 123 nm，在 72 hpf 和 96 hpf 时相比 24 hpf 显著增大（p = 0.0332，p = 0.0036）。
- 透射电子显微镜（TEM）分析：TEM 图像显示，斑马鱼幼虫匀浆沉淀物中的 lEVs 呈杯状，大小约为 150 - 250 nm，背景中可见一些三角形蛋白，推测可能是幼虫血清中的热休克蛋白。匀浆上清液中富集的 sEVs 大小在 70 - 100 nm 之间，同时还能观察到蛋白聚集体。在斑马鱼培养基中则未检测到 EVs。
- 蛋白质免疫印迹（WB）分析：WB 分析表明，sEVs 和 lEVs 都能检测到常用的 EV 标记蛋白 Alix 的强信号，且 lEVs 的信号强度比 sEVs 更强。阴性对照斑马鱼幼虫培养基在预期区域无信号，斑马鱼全蛋白的条带模式与 EVs 不同，证明了抗体对 EVs 的特异性。
在结论与讨论部分，研究人员指出，这是首次对斑马鱼胚胎发育前 96 hpf 内的 EVs 进行全面表征和区分的研究。通过流式细胞术证实了 lEVs 样本的高纯度，WB 分析进一步确认了分离颗粒的 EV 性质，尽管机械匀浆过程无法完全排除人工细胞衍生囊泡（Artificial Cell - derived - Vesicles，ACDVs）的存在，但推测其比例不随斑马鱼幼虫发育阶段变化。NTA 分析揭示了至少存在两种不同的 EV 群体，它们在发育尤其是器官发生过程中可能发挥特定功能。EVs 浓度和 sEVs 大小在胚胎发育过程中的变化，与斑马鱼器官形成的时间相吻合，表明在器官发生前较高的 EV 数量和较大的 sEVs 尺寸可能对斑马鱼胚胎发育和器官形成至关重要。TEM 研究不仅证实了 NTA 的结果，还首次展示了斑马鱼全幼虫 EVs 的图像，进一步确认了分离方法的有效性。然而，目前对于 EVs 亚型及其生理或病理功能的了解仍然有限，未来还需要更深入的研究来揭示这些奥秘。
这项研究的重要意义在于，它为斑马鱼胚胎发育过程中 EVs 的研究提供了关键的基础数据，帮助我们更好地理解胚胎发育过程中细胞间的通信机制，为后续研究 EVs 在脊椎动物胚胎发育中的作用开辟了新的方向，也为相关疾病的研究和治疗提供了潜在的靶点和理论依据，具有广阔的应用前景。
