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为探究 TC2N 在肿瘤发生及干细胞特性中的作用，第三军医大学研究人员构建小鼠模型、进行多种实验。结果发现 TC2N 可通过抑制 DUSP3 磷酸酶，促进肺癌发生并维持癌细胞干细胞特性。该研究为肺癌治疗提供新方向。
肺癌，作为全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病，尽管在癌症的病理生理学、诊断、预后和治疗等方面取得了一定进展，但它依然是导致死亡的主要原因之一。肿瘤发生是一个复杂的过程，其中肿瘤起始细胞（Tumor-initiating cells，TICs），也就是癌症干细胞（Cancer stem cells，CSCs），在肿瘤的发生和发展中起着关键作用。CSCs 具有自我更新和启动肿瘤发生的独特能力，然而目前对于调控 CSCs 的分子机制尚未完全明晰，这也使得寻找针对 CSCs 的精准治疗靶点成为癌症研究领域的迫切需求。
此前研究已发现 TC2N（Tandem C2 domains, nuclear）在肺癌中具有致癌作用，但其在肿瘤发生和干细胞特性调控方面的具体机制仍不明确。为深入探究这些问题，第三军医大学的研究人员开展了一系列研究，并将成果发表于《Cell & Bioscience》。
研究人员运用了多种关键技术方法。在动物实验方面，通过 CRISPR/Cas9 技术构建了 TC2N 基因敲除小鼠模型，以此评估 TC2N 基因敲除对正常肺组织和乌拉坦诱导的肺癌发生的影响；在临床样本研究中，收集了 395 例肺癌患者的肿瘤组织，构建组织微阵列（Tissue microarray，TMA），分析 TC2N 表达与肿瘤分化程度的关系；在细胞实验层面，采用蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）、免疫组化（Immunohistochemical，IHC）等技术检测细胞系和组织样本中 TC2N 及干细胞标记物的蛋白质水平，还利用转录组学和蛋白质组学相结合的方法挖掘 TC2N 的下游信号通路或靶分子。
研究结果如下：
- TC2N 敲除对肺癌发生和正常肺组织的影响：通过构建 TC2N 基因敲除小鼠模型，研究人员发现，在正常饲养条件下，TC2N 基因敲除小鼠的体重、肺组织重量、肺组织外观及超微结构均未出现明显变化，且肺组织中 Clara 细胞标记物 CC10 和 II 型肺泡上皮细胞标记物 SFTPC 的表达也未受影响，这表明 TC2N 表达缺失对正常肺组织的生理功能没有明显影响。然而，在乌拉坦诱导的肺癌发生实验中，TC2N 基因敲除小鼠的肺癌结节数量和大小均显著低于野生型和杂合子小鼠，这说明 TC2N 在乌拉坦诱导的肺癌发生过程中发挥着促进作用。
- TC2N 表达与肺癌干细胞标记物的关系：利用 TCGA 数据库进行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）发现，TC2N 在肺癌组织和正常肺组织中的相关生物学过程存在显著差异。临床样本分析显示，TC2N 表达与肺癌的分化程度呈负相关，高 TC2N 表达与患者预后不良相关。进一步研究发现，在正常肺组织中，TC2N 基因敲除对干细胞标记物（SOX2、OCT4 和 NANOG）的表达没有显著影响；但在乌拉坦诱导的肺癌组织中，TC2N 基因敲除会导致这些干细胞标记物的表达显著降低，这表明 TC2N 可能在维持肺癌细胞的干细胞特性方面发挥重要作用。
- TC2N 对肺癌细胞干细胞样表型的调节作用：通过 GSEA 分析发现，TC2N 在肿瘤组织中的表达与多个干细胞相关的生物学过程有关。在体外细胞实验中，研究人员选取 A549 和 H522 两种肺癌腺癌细胞系进行研究。结果显示，在无血清悬浮培养诱导形成的细胞球中，TC2N 蛋白水平显著上调。进一步构建 TC2N 过表达和干扰细胞模型发现，沉默 TC2N 会显著降低干细胞标记物的表达，减少细胞球的数量和大小；而过表达 TC2N 则会增加干细胞标记物的表达，促进细胞球的形成和增大，同时增加肺癌干细胞标记物 CD133 阳性细胞的比例以及侧群细胞的比例，这表明 TC2N 在维持肺癌细胞的干细胞特性方面起着关键作用。
- TC2N 对肺癌细胞中蛋白磷酸化状态的影响：对 A549 细胞进行基于质谱的磷酸化蛋白质组学分析发现，TC2N 过表达会导致多个与干细胞过程相关的蛋白质的磷酸化水平发生变化，其中 EGFR、ERK1/2、STAT3 和 FAK1 等蛋白的关键位点出现高磷酸化。WB 实验证实，TC2N 基因敲除会降低这些蛋白的磷酸化水平，而过表达则会增加其磷酸化水平。在正常肺组织中，TC2N 基因敲除对这些蛋白的磷酸化水平没有显著影响，但在乌拉坦诱导的肺癌组织中，TC2N 基因敲除会抑制这些蛋白的磷酸化，这表明 TC2N 通过调节蛋白磷酸化参与肺癌的发生过程。
- TC2N 与 DUSP3 的相互作用及对 DUSP3 活性的影响：研究人员发现双特异性蛋白磷酸酶 3（Dual specificity protein phosphatase 3，DUSP3）是 TC2N 的潜在相互作用蛋白。蛋白质对接分析和免疫沉淀实验证实了 TC2N 与 DUSP3 之间的相互作用。进一步研究发现，TC2N 与 DUSP3 的相互作用会阻断 DUSP3 与底物的结合，抑制其水解活性，且这种抑制作用具有特异性。此外，研究还发现 TC2N 与 DUSP3 相互作用的关键区域位于 TC2N 的 N 端。
- DUSP3 在 TC2N 促进肺癌细胞干性中的作用：分析两个独立的大样本肺癌 GEO 数据集发现，DUSP3 在高分化肿瘤中的表达低于低分化肿瘤。在 A549 细胞中过表达 DUSP3 会显著降低 CD133+和侧群细胞的比例，表明 DUSP3 可能是干细胞特性的候选抑制剂。干扰 DUSP3 的表达能够逆转 TC2N 基因敲低导致的 EGFR、ERK1/2、STAT3 和 FAK1 的去磷酸化，恢复干细胞标记物的表达，同时逆转 TC2N 基因敲低对 CD133 阳性细胞和侧群细胞比例的抑制作用，这表明 TC2N 通过抑制 DUSP3 来促进肺癌细胞的干性和肿瘤进展。
研究结论和讨论部分指出，TC2N 首次被揭示具有促进肿瘤发生和增强干细胞样特性的作用。TC2N 可通过阻断 DUSP3 对 EGFR、ERK、STAT3 和 FAK1 信号通路的抑制作用，从而促进肺癌的发生发展。然而，目前仍存在一些问题有待进一步研究，例如 TC2N 调节细胞分化的具体机制尚不明确，TC2N 是否通过其他非 DUSP3 依赖的机制影响细胞干性也有待探索。未来研究可聚焦于 TC2N 的蛋白质结构和功能，以深入了解其在肿瘤发生和发展中的作用机制，为肺癌的治疗提供更精准有效的策略。这项研究为肺癌的发病机制和治疗研究提供了新的视角和潜在的治疗靶点，具有重要的理论和临床意义。
