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在细胞毒性检测方法存在局限性的背景下，研究人员开展基于荧光蛋白释放检测细胞毒性的研究。结果表明该方法可用于共培养中不同细胞系死亡检测，且发现不同 3D 培养对卡培他滨敏感性存在差异，为药物筛选和病理建模提供了新手段。
在生命科学和医学研究中，细胞毒性检测是评估化学物质和生物制品安全性与有效性的关键环节。目前，用于测定细胞毒性的方法众多，像广泛使用的 MTT 和 LDH 等筛选试验，以及 PI 和台盼蓝染色等适用于单个样本的方法 。然而，这些方法都存在一定缺陷，没有一种方法能可靠地确定 TC
50/EC
50，且不同方法间的结果差异较大。有时差异可达两倍甚至更多，这种偏差可能源于药物本身对吸收光谱的影响（在使用分光光度法时），也可能是由于实验操作的细微差别，比如未严格遵循时间间隔、接种细胞数量有误、将错误的代谢参数作为细胞活力指标，或是染色剂本身的作用等。为了解决这些问题，俄罗斯的研究人员开展了一项极具创新性的研究，相关成果发表在《BMC Molecular and Cell Biology》上。
研究人员提出了一种基于荧光蛋白释放检测细胞毒性的新方法。该方法主要适用于大规模高通量筛选，其原理是利用表达荧光蛋白（如 GFP、RFP 等）的修饰细胞系。当细胞死亡时，荧光蛋白会释放到培养基中，就如同 LDH 酶在同名检测中一样，随后可用荧光分光光度计检测。
研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。首先是构建稳定表达荧光蛋白的细胞系，他们使用慢病毒载体转导技术，创建了 Huh7-GFP、NCI-H1299-GFP、NCI-H1299-RFP 等修饰细胞系。接着，通过在 96 孔板或 48 孔板进行细胞接种实验，对不同细胞系进行培养，之后添加待测化合物评估其细胞毒性。实验过程中，还使用了荧光分光光度计检测荧光强度，以此确定细胞活力。
下面来看具体的研究结果：
- 概念验证实验：通过该实验验证了方法的可行性。实验选用 NCI-H1299-GFP 和 NCI-H1299-RFP 细胞系，结果显示在相应的激发和发射通道中检测特异性极高，证明能够检测到细胞死亡或裂解后释放的荧光蛋白的荧光信号，且能在至少两个不同通道中独立测量释放蛋白的荧光。
- 测定卡培他滨细胞毒性（2D 培养）：以 NCI-H1299-RFP、NCI-H1299-GFP 和 Huh7-GFP 细胞为研究对象，采用该新方法测定卡培他滨在单培养和共培养中的细胞毒性。研究发现，计算得出的 NCI-H1299-RFP 和 NCI-H1299-GFP 的 TC50在 RFP 和 GFP 通道中存在差异，可能是由于细胞分解产物在 GFP 类似范围内有较强荧光，干扰了结果。同时，还计算出了不同细胞系及共培养条件下卡培他滨的 IC50。
- 测定卡培他滨细胞毒性（3D 培养）：
- 球体培养：利用悬挂滴法获得 NCI-H1299-RFP 和 Huh7-GFP 细胞的球体，研究发现存在代谢细胞（Huh7）时，卡培他滨对 NCI-H1299 细胞的毒性显著降低，且 Huh7 细胞在单培养和共培养中的活力变化不大，表明 Huh7 细胞会影响 NCI-H1299 细胞，而非相反。
- 藻酸盐水凝胶培养：制备包含不同细胞系的藻酸盐水凝胶 3D 培养物，实验结果显示细胞对卡培他滨的敏感性急剧下降，且在所有单培养和共培养情况下均是如此。增加卡培他滨浓度，细胞死亡有所增加，但幅度不大。
- 确定重金属对测量结果的影响：以 NCI-H1299-GFP 和 NCI-H1299-RFP 细胞为材料，研究发现即使少量的钴（500 μM）也能使 GFP 荧光降至初始裂解物荧光的 57%，RFP 降至 84%，而卡铂对蛋白质荧光无显著影响。
- 评估药物代谢物对荧光蛋白的影响：使用 Huh7、Huh7-GFP、NCI-H1299-GFP 和 NCI-H1299RFP 细胞进行实验，以对乙酰氨基酚为模型化合物。结果发现，随着对乙酰氨基酚浓度增加，细胞死亡图出现 “驼峰”，之后 “驼峰” 变平滑，荧光水平下降。同时，共培养中加入 Huh7 细胞会增加 NCI-H1299 细胞的死亡，这表明该方法难以准确测量会与蛋白质形成加合物、破坏蛋白质结构的物质的细胞毒性。
研究结论和讨论部分指出，这项研究证明了在共培养中独立检测不同细胞系细胞死亡的可行性，为研究细胞间相互作用提供了新方法。此外，该方法不仅可用于筛选有前景的药物，还能用于模拟病理条件。研究还发现了不同 3D 培养（球体和藻酸盐水凝胶）对卡培他滨敏感性的差异，为体外毒理学研究提供了新方向。然而，该方法也存在一些缺点，如半定量、对易与蛋白质结合的重金属敏感、在药物或其代谢物易与含硫氨基酸形成加合物的情况下实用性较低等。不过，使用抗加合物形成的无半胱氨酸荧光蛋白（如 cfSGFP2）有望解决这些问题。总体而言，这项研究为细胞毒性检测领域带来了新的思路和方法，具有重要的理论和实践意义，推动了生命科学和医学研究在细胞毒性检测方面的发展。
