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在昆虫线粒体基因组研究中，获取样本困难及传统测序方法存在不足。研究人员针对两种蠓（Forcipomyia (Lasiohelea) humilavolita 和 Dasyhelea bilineata）开展线粒体基因组研究，运用双片段克隆法测序分析，发现其线粒体基因组特征，该方法或可广泛用于昆虫研究。
在昆虫的微观世界里，线粒体基因组宛如一座蕴含无数遗传奥秘的宝藏，吸引着众多科研人员去探索。线粒体基因组作为昆虫细胞内的 “能量工厂” 线粒体的遗传物质，对于揭示昆虫的进化历程、种群关系以及适应机制等方面有着至关重要的意义。然而，在过去的研究中，这座宝藏的挖掘却困难重重。
一方面，昆虫线粒体基因组测序通常需要大量的样本，可对于某些身形娇小、难以捕捉或珍稀的昆虫物种来说，获取足量样本犹如大海捞针。就拿蠓科昆虫来说，它们体型微小，体长仅 1 - 5 毫米，想要收集到满足传统测序需求的样本数量极为不易。另一方面，传统的测序方法也存在诸多弊端。像长 PCR 方法，不仅需要设计复杂的简并引物或多对引物，操作过程繁琐，而且成功率也不尽如人意。在这样的困境下，开展一项能够突破这些限制的研究迫在眉睫。
遵义医科大学的研究人员勇挑重担，踏上了探索蠓科昆虫线粒体基因组的征程。他们以 Forcipomyia (Lasiohelea) humilavolita 和 Dasyhelea bilineata 这两种蠓为研究对象，运用创新的双片段克隆法，对其线粒体基因组进行测序和分析。经过不懈努力，研究取得了丰硕成果，相关论文发表在《BMC Genomics》上。
研究人员在开展研究时，运用了多种关键技术方法。首先是样本采集与 DNA 提取，他们使用马来氏网在贵州遵义采集成年雌性蠓样本，经处理后用试剂盒提取微尺度全基因组 DNA。接着通过 PCR 扩增，利用通用引物扩增 COX1 和 16S rRNA 的初始片段，再用基因特异性引物和单轮 PCR 或巢式 PCR 扩增线粒体基因组片段。最后进行测序与分析，对扩增产物混合后进行 Illumina 测序，经数据处理和过滤后，使用多种软件对线粒体基因组进行注释、分析碱基组成、密码子使用等，并构建系统发育树。
研究结果如下：
- 克隆、测序及基因组特征：成功克隆两种蠓的部分 COX1 和 16S rRNA 序列，进而通过双片段克隆法获得线粒体基因组片段。F. humilavolita 和 D. bilineata 的线粒体基因组全长分别为 16,885 bp 和 16,189 bp，均包含 13 个蛋白编码基因 (PCGs)、22 个转运 RNA (tRNA) 基因、2 个核糖体 RNA (rRNA) 基因和 1 个控制区。它们的核苷酸组成偏向 A + T，分别达 78.15% 和 78.25%，且呈现不同的 AT 和 GC 偏斜。
- 基因重叠、间隔区和非编码区：两种蠓的线粒体基因组存在基因重叠现象，F. humilavolita 有 5 处，D. bilineata 有 8 处，重叠长度为 1 - 8 bp。同时也存在基因间隔区，F. humilavolita 最长间隔区为 76 bp，D. bilineata 最长为 39 bp。控制区是基因组中最具变异性的区域，在两种蠓中长度不同，且都呈现负向的 AT 和 GC 偏斜。
- 蛋白编码基因、密码子使用和相对同义密码子使用：13 个 PCGs 的总长度在两种蠓中分别为 11,187 bp 和 11,193 bp，具有特定的 AT 和 GC 偏斜。多数 PCGs 以标准 ATN 密码子起始，部分基因的起始和终止密码子在两种蠓中存在差异，部分基因终止密码子为不完整的 T。RSCU 分析表明，亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸是使用频率较高的氨基酸。
- 转运 RNA 和核糖体 RNA 基因：22 个 tRNA 基因中，14 个在重链编码，8 个在轻链编码。除 trnS1 - NCU 外，其他 tRNA 均可折叠成经典的三叶草二级结构，且存在 G - U 碱基对和错配碱基对。rRNA 基因包括 16S rRNA 和 12S rRNA，在两种蠓中的长度不同，且呈现不同的 AT 和 GC 偏斜。
- 系统发育推断：基于 PCGAA 和 PCG123RNA 数据集，运用不同算法构建系统发育树。结果显示，六种蠓科昆虫聚为一类，属于不同的亚科和属，这为蠓科昆虫的分类和进化研究提供了重要依据。
研究结论和讨论部分意义重大。此次研究首次成功运用双片段克隆法从微尺度全基因组 DNA 中测序分析两种蠓的线粒体基因组，揭示了其基因组成、结构和进化特征。发现不同 PCG 基因终止密码子和 AT 偏斜的差异，为进一步研究蠓科昆虫种属间的遗传差异提供了方向。而且该方法在研究起始步骤使用通用引物，有望广泛应用于多种昆虫线粒体基因组研究，为昆虫学领域的遗传研究开辟了新途径，有助于深入了解昆虫的进化历程和种群关系，为害虫防治、生物多样性保护等实际应用提供理论支持 。
