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为解决非模式物种缺乏高效基因分型解决方案的问题，研究人员开展了优化基因分型测序（GBS）双 - 酶切限制性位点相关 DNA 测序（ddRAD）流程的研究。结果显示该策略成本效益高，参考基因组并非必需。这一成果有助于推动 GBS 在多种养殖物种中的应用。
在动物养殖领域，随着物种驯化数量的增加，对基因分型的需求愈发迫切。然而，许多非模式物种缺乏参考基因组信息，这使得开发高效的基因分型方法成为难题。基因组选择依赖于可靠的基因关系估计和大量的 DNA 标记，但现有的基因分型技术在准确性、成本和效率方面存在不足，限制了其在非模式生物中的应用。为了攻克这些难题，芬兰自然资源研究所（Luke）的研究人员 Daniel Fischer、Miika Tapio 等人开展了相关研究。
研究旨在优化 GBS 的 ddRAD 流程，微调生物信息学流程参数，以获取高质量的单核苷酸多态性（SNP）数据，用于非模式物种的基因组选择，并测试数据生成的可重复性。该研究成果发表在《BMC Genomics》上，为推动非模式物种的基因组选择和育种实践提供了重要的理论支持和技术手段。
研究中使用的主要关键技术方法包括：一是模拟酶切选择合适的限制性内切酶对，通过模拟软件 SimRAD 评估不同酶对产生的片段数量和预期变异数；二是构建模拟参考基因组，对比不同样本选择策略构建模拟参考基因组的效果；三是运用开发的 Snakebite - GBS 管道进行变异检测，该管道基于 GBS - SNP - CROP 管道开发，使用多种工具和过滤器获得最终变异集。
研究结果如下：
- 限制性内切酶选择：通过计算机模拟发现，EcoRI; SphI 酶对产生的双酶切基因组片段数量和预期变异数最符合要求，且片段大小分布均匀，是目前评估物种的最佳选择。
- 原始测序数据：对奶牛和欧洲白鱼样本进行 GBS 和全基因组重测序（WGS），奶牛 GBS 测序平均每个样本产生 1197475 对末端（PE）读数，欧洲白鱼 GBS 测序平均每个样本产生 1190565 PE 读数。
- GBS 片段回收：奶牛 GBS 数据经质量修剪后，约 86% 的读数与 150 - 400bp 大小范围内的片段对齐，据此预期模拟参考基因组的簇数量。
- 模拟参考基因组质量：比较不同样本选择策略构建模拟参考基因组的效果，发现使用三个样本构建的模拟参考基因组（mock - strategy 3）最佳，同时确定了模拟参考基因组创建和优化的最佳参数。
- 变异检测和 GBS 质量评估：对奶牛样本，使用不同方法进行变异检测并比较结果，发现基于模拟参考基因组和参考基因组的变异检测结果相似，且约 5000 个 GBS 标记相当于 2000 个 WGS 衍生的 SNP 标记，可满足基因组选择需求。对欧洲白鱼样本，使用模拟参考基因组和现有参考基因组均能检测到大量 GBS 变异，且基因组相关性估计符合预期。
- 重复性：奶牛 GBS 数据重复性高，三次独立运行共享大量变异位点；欧洲白鱼数据重复性在技术重复间较高，但在不同样本制备重复间较低。
研究结论和讨论部分指出，该研究开发的 ddRAD GBS 协议在牛和欧洲白鱼样本中均能获得可靠的相关性估计，展示了其通用性。虽然现有参考基因组可提高变异检测的质量和数量，但即使没有参考基因组，也不影响基于 GBS 的基因组评估和选择。此外，研究还发现实验中仍存在一些挑战，如欧洲白鱼基因组重复区域导致的读数比对问题影响变异检测重复性。未来可进一步优化实验流程，如调整片段大小窗口、使用甲基化敏感的限制性内切酶等，以提高效率和准确性。该研究成果为非模式物种的基因组选择提供了有效方法，有助于推动动物育种实践的发展。
