温度胁迫下牙鲆(Paralichthys olivaceus)基因表达分析中内参基因的转录组学鉴定与评估

本研究针对水产养殖中温度胁迫影响牙鲆基因表达研究的痛点，通过RNA-Seq技术从36个转录组数据中筛选出rpl6、gatd1等8个新型内参基因，采用geNorm等四种算法验证其稳定性，发现其表达稳定性显著优于传统actb和18S RNA基因，为鱼类温度应激研究提供了更精准的qRT-PCR标准化方案，对水产抗逆育种具有重要指导价值。

　　在气候变化加剧的背景下，水温波动已成为威胁水产养殖业的关键环境因素。作为东亚地区重要的经济鱼种，牙鲆(Paralichthys olivaceus)在养殖过程中常遭遇夏季高温和冬季低温胁迫，导致生理机能紊乱甚至大规模死亡。虽然定量实时PCR(qRT-PCR)是研究鱼类应激反应基因表达的金标准，但长期以来研究者们习惯性地沿用哺乳动物研究的传统内参基因如β-肌动蛋白(actb)和18S核糖体RNA(18S RNA)，这些基因在鱼类温度应激条件下已被证实存在表达波动，可能导致数据偏差。更棘手的是，目前牙鲆温度应激研究缺乏系统性的内参基因筛选，严重制约了相关分子机制研究的可靠性。

针对这一科学瓶颈，宁波大学等单位的研究团队创新性地整合转录组学和分子生物学技术，在《BMC Genomics》发表了突破性研究成果。研究人员首先构建了包含36个转录组数据集的数据库（NCBI登录号PRJNA717098等），涵盖常温(18℃)、热应激(28℃)和冷应激(8℃)三组条件下牙鲆鳃、肝、脾和心脏四种组织。通过四步筛选标准：基因表达普遍性（I）、低组织间变异（II）、无异常表达（III）和中等以上表达量（IV），从24,419个基因中锁定8个候选内参基因，包括核糖体蛋白L6(rpl6)、谷氨酰胺氨基转移酶(gatd1)等。这些基因的变异系数(CV)均<0.1，显著优于传统内参基因(CV>0.1)。研究团队进一步采用组织病理学验证温度应激模型有效性，通过HE染色观察到鳃丝肿胀、肝细胞间隙扩大等典型应激损伤，同时热图分析显示hsp70等热激蛋白和cirbp等冷应激标志基因显著差异表达。

关键技术方法包括：1）建立温度梯度应激模型（40.5±1.5 cm规格牙鲆，750.5±67.8 g体重）；2）Illumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序，TPM值量化基因表达；3）使用geNorm、NormFinder、BestKeeper和delta-Ct四种算法评估基因稳定性；4）qRT-PCR验证（Light Cycler 480系统，引物效率94.09%-103.37%）。

研究结果部分，"温度应激证据"显示：组织病理学观察到鳃丝融合、脾脏黑素巨噬细胞中心增加等特征，同时hsp90α和csde1等分子标志物表达显著改变，证实模型构建成功。"转录组鉴定"环节发现：候选内参基因log₂(TPM)波动范围显著小于传统基因（如gatd1:5.4-6.7 vs 18S RNA:0.3-10.7）。"qRT-PCR验证"数据显示：rpl6的Ct值变异最小（19.7-24.8），而18S RNA波动最大（12.3-29.2）。综合四种算法评估，"稳定性分析"揭示：rpl6和gatd1在全部评估体系中稳居前两位，其中geNorm分析显示其稳定性值M<0.5，远优于actb(M>1.0)。

讨论部分强调：核糖体蛋白rpl6和代谢相关gatd1的优异稳定性可能源于其参与基础生命过程——rpl6是核糖体60S亚基组分，参与DNA损伤修复；gatd1则催化氨基化反应，两者均为细胞存活必需。相比之下，传统基因如actb涉及细胞骨架重构，18S RNA参与应激响应，导致温度条件下表达波动。该研究首次实现三个突破：1）建立牙鲆温度应激研究的标准化内参体系；2）证实转录组筛选优于经验选择；3）为其它经济鱼类内参基因选择提供范式。未来研究可拓展至不同发育阶段和病原感染等复合应激场景，进一步完善水产动物基因表达研究的标准化体系。