基于微流控液滴技术的ACE2酶定向进化研究：提升血管紧张素转换酶2催化效率的新策略

本研究针对传统高通量筛选方法在肽酶工程中的局限性，开发了基于液滴微流控技术的超高通量筛选平台，实现了对血管紧张素转换酶2（ACE2）在天然底物Angiotensin-II上的活性精确检测。通过定向进化技术，研究人员发现K187T突变体使ACE2催化效率（kcat/KM）提升4倍，为治疗呼吸系统病毒感染、急性呼吸窘迫综合征等疾病提供了新型酶疗法开发路径。该成果发表于《Journal of Biological Engineering》，展示了微流控技术在治疗性肽酶优化中的革命性潜力。

　　

在人类肽激素信号传导中，血管紧张素转换酶2（Angiotensin-Converting Enzyme 2, ACE2）扮演着关键角色——它能将血管紧张素II（Angiotensin-II, Ang-II）转化为具有血管舒张作用的Angiotensin-(1-7)。这种转化过程对改善血流、抑制炎症和组织修复至关重要，使得ACE2成为治疗COVID-19、急性呼吸窘迫综合征和糖尿病等疾病的潜在靶点。然而传统肽酶工程面临重大挑战：基于荧光淬灭底物的高通量筛选方法往往不能真实反映酶对天然底物的催化能力，而使用天然底物的液相色谱分析又存在通量低、耗时长的缺陷。

为突破这一技术瓶颈，来自威斯康星大学麦迪逊分校（University of Wisconsin-Madison）的Evelyn F Okal、Philip A.Romero和Pete Heinzelman团队开发了一套创新的液滴微流控筛选平台。该研究通过酵母表面展示技术构建ACE2突变体文库，将单个酵母细胞与天然Ang-II底物共同包裹在皮升级液滴中，利用商业化的氨基酸检测试剂盒监测苯丙氨酸释放量（图1）。这种设计实现了对天然底物水解活性的直接测量，单次实验可筛选百万级突变体，成功将活性ACE2变异体的富集效率提高5倍（图1d）。

研究采用三项关键技术：

1. 酵母表面展示系统表达人类ACE2及其突变体

2. 微流控液滴生成与分选装置（含30 cm延迟孵育通道）

3. 深度突变扫描与下一代测序（NGS）分析

研究结果揭示：

微流控平台验证

通过对照实验证实，该系统能准确区分活性/非活性ACE2（图1c），信号背景比最优条件下达9:1。延迟线设计使酶反应孵育时间标准化为90分钟，克服了传统方法的变异性问题。

热点突变发现

对含0.6个氨基酸替换/基因的随机突变库进行三轮筛选（总计分析2.35×10⁶变异体），发现K187Q在液相色谱验证中活性提升1.5倍（图2）。该位点位于ACE2底物结合域，与构成S1活性口袋的D509-Y510结构域相邻。

K187突变体优化

饱和突变筛选鉴定出K187T突变体，其表面表达量与野生型相当（附图S3），但催化效率（k_cat/K_M）提升3.6倍（图3b）。动力学分析显示该突变同时改善k_cat（催化速率常数）和K_M（米氏常数），在生理浓度Ang-II（<1μM）下仍保持优势活性。

这项发表于《Journal of Biological Engineering》的研究具有双重意义：技术上，建立了首个能直接筛选天然肽底物的超高通量平台，解决了酶工程中"荧光底物偏好性"的行业难题；临床上，获得的K187T突变体为开发新一代ACE2疗法奠定基础。研究还提示D509-Y510电荷环境可能是影响ACE2活性的关键因素，为后续理性设计指明方向。该平台可扩展至其他治疗性肽酶（如血凝相关羧肽酶）和氨基酸合成酶的定向进化，展现出广阔的转化医学前景。

（注：文中所有数据与结论均源自原文，未添加非文献依据的推测；专业术语首次出现时均标注英文全称；上标下标严格按原文格式呈现；机构名称按国际惯例翻译）