基于CRISPR多基因编辑与免疫检查点阻断协同治疗胶质母细胞瘤的“一体化”多功能细胞外囊泡递送系统

编辑推荐：针对胶质母细胞瘤(GBM)治疗难题，空军军医大学团队开发了兼具免疫调节与基因编辑功能的工程化细胞外囊泡(EV)递送系统。通过表面展示PD-1和angiopep-2的EV搭载CRISPR-Cas9系统，实现PLK1(58.6%)和VEGF(52.7%)双基因编辑，显著增强CD8+ T细胞抗肿瘤活性并重塑免疫微环境，为GBM联合治疗提供新范式。

　　

胶质母细胞瘤(GBM)作为最具侵袭性的原发性脑肿瘤，患者中位生存期不足2年，传统治疗手段收效甚微。这种"冷肿瘤"特征表现为免疫抑制微环境和血脑屏障(BBB)阻碍药物递送的双重困境。更棘手的是，单一疗法难以同时解决肿瘤细胞增殖、血管异常增生和免疫逃逸等多重病理机制。面对这些挑战，空军军医大学的研究团队在《Journal of Nanobiotechnology》发表创新成果，通过工程化细胞外囊泡(EV)构建"多管齐下"的治疗方案。

研究采用基因工程改造EV表面共表达PD-1和angiopep-2，内部装载Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合物(RNP)，创建了AP-sgPV-EV系统。关键技术包括：1) 通过Lamp2b和CD9融合实现双靶向修饰EV膜蛋白；2) 采用RCAS/tv-a系统建立自发GBM小鼠模型；3) 质谱流式(CyTOF)分析41种免疫标志物；4) T7E1和NGS验证多基因编辑效率；5) 体外BBB模型评估跨屏障能力。

结果部分：

1. 多功能EV的理性设计
   通过将PD-1与CD9、angiopep-2与Lamp2b融合，成功构建粒径122±15 nm的双功能EV。电镜显示工程化EV保持典型双层结构，ELISA证实PD-1可与PD-L1特异性结合，免疫荧光显示其靶向PD-L1⁺细胞的能力。

2. 高效多基因编辑
   体外实验显示AP-sgPV-EV在GL261细胞中PLK1和VEGF编辑效率达91.4%和85.7%，Western blot显示蛋白表达分别降低75%和50%。 caspase 3/7活性提升3倍，52.78%细胞发生凋亡，内皮细胞管形成减少60%。

3. 跨越BBB与肿瘤靶向
   体外Transwell模型证实Ang修饰使EV透过bEnd.3单层的能力提升4倍。活体成像显示双修饰EV在肿瘤部位富集量是普通EV的8倍，12小时即可在PD-L1高表达区域聚集。

4. 协同治疗效果
   在GL261原位模型中，AP-sgPV-EV组中位生存期延长至39天(对照组27.5天)，自发GBM模型生存期达42天。免疫组化显示Ki-67⁺细胞减少70%，CD31⁺血管密度下降65%，TUNEL⁺细胞增加5倍。

5. 免疫微环境重塑
   CyTOF分析揭示治疗组CD8⁺效应T细胞(Cluster 15)扩增3倍，MDSC(Cluster 7)减少80%。PD-L1⁺巨噬细胞比例从22%降至7%，而γδT细胞(Cluster 12)增加2.5倍。

结论与意义：
该研究开创性地将免疫检查点阻断与CRISPR编辑整合于天然EV载体，突破传统联合治疗药物递送不同步的瓶颈。PD-1表面展示使EV兼具"药物"与"递送载体"双重属性，angiopep-2修饰实现BBB穿越与LRP-1靶向的"一箭双雕"。双基因编辑同时抑制PLK1(调控细胞周期)和VEGF(促血管生成)，产生"抑瘤+抗血管+免疫激活"的三重协同效应。安全性评估显示主要器官突变频率<0.5%，为临床转化奠定基础。这种模块化设计策略为其他难治性肿瘤的"all-in-one"治疗提供普适性平台。