Ribo-M-Seq：一种基于核糖体RNA去除和多重标记的高通量测序技术在木薯病毒组检测中的应用

为解决木薯病毒检测成本高、通量低的问题，研究人员开发了Ribo-M-Seq技术，通过RNaseH介导的核糖体RNA去除和96重标记方案，成功检测到包括Begomovirus和Ipomovirus在内的DNA/RNA病毒近全长基因组，首次发现木薯相关Ampelovirus（MEaV），为大规模流行病学研究提供经济高效的解决方案。

　　

木薯作为非洲8亿人口的主粮作物，正遭受由Geminiviridae（ssDNA）和Potyviridae（ssRNA⁺）病毒引起的毁灭性病害威胁。传统检测方法难以应对复杂流行病学场景，而现有高通量测序技术因核糖体RNA去除和文库构建成本高昂难以推广。针对这一困境，Daniel H.Otron团队开发了创新性Ribo-M-Seq技术方案。

该研究采用RNaseH介导的核糖体去除技术，设计273条木薯特异性DNA探针，结合96重分子标记策略，对来自科摩罗、马达加斯加等地的木薯样本（含已知病毒复合感染）进行检测。通过Illumina NovaSeq 6000平台测序，使用MMseqs2进行序列比对，SPAdes组装病毒基因组，并构建最大似然系统发育树验证病毒进化关系。

在方法学验证方面，研究证实RNaseH处理可使核糖体RNA reads从95.7%降至0.5%，同时保留95.6%的宿主基因组序列。病毒检测灵敏度达到100 reads/百万reads的阈值，背景噪音控制在30个病毒reads以内。值得注意的是，在样本293MG040711中不仅检出已知的ACMV、EACMCV和EACMKV三种Begomovirus，还意外发现MEaV-2（Closteroviridae），其1,830 nt contigs与马达加斯加分离株高度同源。

关于技术性能评估，研究显示在1,000万reads测序深度下，DNA-A组分覆盖度达90%，但RNA病毒基因组覆盖呈现梯度增长趋势，表明增加测序量可提升组装完整性。通过数学模型推算，该方法可实现32个样本的性价比最优多重分析，单个样本处理成本约18欧元。

讨论部分强调，该技术突破传统检测方法的三大局限：1）同步检测DNA/RNA病毒能力；2）发现MEaV等新型病毒的证据；3）经济性适合资源有限地区。虽然样本保存年限（最长11年）影响RNA质量，但新鲜样本84%的reads分类率预示其在主动监测中的潜力。研究者建议将该技术整合到西非木薯病虫害综合治理项目中，为作物保护决策提供分子流行病学依据。

这项发表于《Virology Journal》的研究，通过巧妙的实验设计和严谨的生物信息学验证，建立了植物病毒组研究的新标准。其创新性在于将工业级探针设计、酶学去除与多重标记策略相结合，为资源有限地区的作物病毒监测提供了可推广的技术范式。未来研究方向包括优化样本保存方案、开发自动化分析流程，以及将该技术扩展至其他重要经济作物。