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为探究高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）在光化学血栓性脑卒中（PTS）后诱导 NETosis 的作用，Inha University 研究人员用大鼠 PTS 模型开展研究。结果显示，HMGB1 可诱导 NETosis 加重脑损伤，抑制其可减轻损伤。该研究为脑卒中治疗提供新策略。
在人体的免疫系统中，中性粒细胞就像一群时刻准备战斗的卫士，当身体受到感染时，它们会迅速奔赴战场。其中，中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是它们对抗病原体的一种强大武器，由解聚的染色质和颗粒内容物释放形成。然而，就像一把双刃剑，NETs 在对抗感染的同时，过度形成却会引发一系列问题。在中枢神经系统疾病中，比如脑卒中，NETs 的过度出现就被发现与脑损伤的加重密切相关。高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）作为一种危险相关分子模式（DAMP）分子，在多种非感染性疾病中被证实能诱导 NETs 形成。但在光化学血栓性脑卒中（PTS）这种特定的脑卒中模型中，HMGB1 在诱导 NETosis 方面的作用，尤其是血小板源 HMGB1 对中性粒细胞激活的影响，还尚不明确。为了解开这些谜团，来自 Inha University 的研究人员展开了深入研究，其研究成果发表在《Molecular Medicine》杂志上。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先建立了大鼠 PTS 模型，通过激光多普勒血流仪监测局部脑血流；采用 TTC 染色评估梗死体积，利用改良神经功能缺损评分（mNSS）评价神经功能；运用免疫荧光染色、免疫印迹以及酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术，检测相关蛋白表达和血清中分子水平。
研究结果如下：
- PTS 模型中梗死灶的发展：通过 TTC 染色发现，PTS 模型在术后 1 小时就可检测到梗死灶，且梗死体积迅速扩大，一直持续到 24 小时，表明梗死灶呈快速但渐进性的扩张。
- NETosis 的诱导：在 PTS 模型中，无论是脑实质还是血管内都发生了 NETosis。从时间进程来看，术后 6 小时，缺血核心区和半暗带的髓过氧化物酶（MPO，中性粒细胞激活的标志物）显著增加，CitH3（NETosis 的标志物）也明显升高，且在 12 小时进一步增加。循环中性粒细胞从术后 1 小时开始，CitH3 和 MPO 水平显著上升，血清中游离 DNA 含量也从 1 小时开始增加，一直持续到 24 小时，这些都表明 PTS 后发生了快速且显著的 NETosis。
- 抑制 PAD4 的作用：PAD4 是通过使组蛋白 H3 瓜氨酸化触发 NETosis 的酶。研究人员给予 PTS 动物 BB-Cl-amidine（BBCA，一种抑制 PAD4 的 NETosis 抑制剂）后发现，无论是在 PTS 手术前 30 分钟给药，还是术后 2 小时或 4 小时给药，都能显著抑制 PMNs 中 CitH3 和 MPO 的诱导，降低血清中游离 DNA 水平，减少梗死体积，改善神经功能评分，这说明 NETosis 在 PTS 后脑损伤的加重中起到关键作用。
- HMGB1 的表达与定位：在 PTS 模型中，HMGB1 在梗死核心区水平逐渐降低，在半暗带略有增加，在 PMNs 中从术后 1 小时开始显著诱导，在血清中从术后 1 小时开始迅速积累并持续上升。免疫荧光染色显示，HMGB1 不仅存在于神经元中，还在术后出现在血管内的活化中性粒细胞和血小板中。
- HMGB1 A box 的作用：给予 HMGB1 A box（HMGB1 的拮抗肽）后，能显著抑制 PTS 后 12 小时 PMNs 中 CitH3 和 MPO 的升高，降低血清中游离 DNA 水平，减少梗死体积，改善 mNSS 评分，且抑制效果呈时间依赖性，这表明抑制 HMGB1 可有效抑制 NETosis，减轻脑损伤。
- 血小板的激活：PTS 术后，血小板迅速激活，表现为血小板中 P - 选择素（CD62P）水平在术后 1 小时显著升高并持续到 24 小时，GP1bα（CD42b）在血小板中减少但在血清中增加，同时血小板中磷酸化 - AKT（p-AKT）水平升高。此外，血小板中 HMGB1 水平在术后 1 小时明显下降，之后逐渐恢复，且观察到 HMGB1 向血小板质膜的快速转位和分泌。
- 血小板源 HMGB1 的作用机制：通过共培养实验发现，与术后 3 小时分离的血小板共培养的正常 PMNs 中，CitH3 和 MPO 水平显著升高，而预先用 HMGB1 A box 处理可显著减弱这种升高，说明术后 3 小时的血小板能诱导 NETosis，且 HMGB1 在其中起关键作用。同时，用 TLR4 抑制剂处理 PMNs 后，血小板诱导的 NETosis 显著受抑制，表明血小板源 HMGB1 通过 TLR4 信号通路在中性粒细胞激活中起关键作用。
研究结论和讨论部分指出，在 PTS 模型中，HMGB1 在介导中性粒细胞和血小板相互作用方面起着关键作用。NETosis 不仅在血栓形成初期发挥作用，还在 PTS 后脑损伤的进展中起到重要作用，抑制 NETosis 可减轻脑损伤。虽然之前在其他疾病模型中已发现血小板源 HMGB1 的重要作用，但本研究首次在 PTS 模型中证实其意义。此外，研究还发现不同氧化还原形式的 HMGB1 在诱导 NETosis 中的作用存在差异，血小板源 HMGB1 诱导 NETosis 主要通过 dsHMGB1-TLR4 信号通路，但不同形式 HMGB1 的具体作用和相关受体仍需进一步研究。总的来说，该研究表明 NETosis 可作为急性缺血性脑卒中的有价值的预后标志物，通过调节 HMGB1 来靶向 NETosis 可能是减轻缺血性脑损伤的有前景的治疗策略，为未来脑卒中的治疗提供了新的思路和方向。
