经玻璃体与经巩膜视网膜下注射：小鼠光感受器细胞死亡与神经炎症的差异及意义

为探究经玻璃体（TV）和经巩膜（TS）视网膜下注射对宿主视网膜免疫介导的光感受器损伤的影响，研究人员开展相关研究。结果发现两种注射方式在光感受器细胞死亡、白细胞亚型浸润等方面存在差异。这为视网膜下给药及相关治疗策略提供了重要参考。

　　在眼科医学的广阔领域中，视网膜疾病一直是困扰众多患者的难题。视网膜下空间（SRS）作为连接神经感觉视网膜和视网膜色素上皮（RPE）的特殊区域，为光感受器及其他视网膜神经元的治疗带来了希望。通过视网膜下注射基因载体和细胞疗法，有望为视网膜退行性疾病患者提供神经保护和再生的新途径。然而，目前常用的经玻璃体（TV）和经巩膜（TS）两种视网膜下注射方法，在操作过程中涉及不同的眼部结构，这使得它们对宿主视网膜免疫介导的光感受器损伤的影响尚不明确。为了揭开这一谜团，来自美国伊利诺伊大学芝加哥分校、哈佛医学院等机构的研究人员展开了深入研究，其成果发表在《Journal of Inflammation》上。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，构建了 TV 和 TS 视网膜脱离（RD）小鼠模型，通过向小鼠腹腔注射麻醉剂进行麻醉，再使用特定药物散瞳和局部麻醉后进行手术操作。其次，采用免疫荧光技术，对视网膜样本进行处理，通过标记特定蛋白来观察细胞情况；运用流式细胞术，将视网膜处理成单细胞悬液，检测不同细胞的表达情况。此外，还进行了统计分析，利用特定软件对数据进行处理，判断结果是否具有统计学意义。

研究结果

1. TV 和 TS 视网膜脱离模型的近期应用情况：研究人员通过文献检索发现，从 2003 年到 2023 年，这两种实验模型的使用呈稳步上升趋势。在 2003 - 2011 年期间，TV 模型使用更为频繁；但自 2012 年起，TS 模型后来居上，成为目前最广泛应用的临床前视网膜脱离模型。
2. TS 视网膜脱离模型在早期视网膜脱离中诱导更高的 CCR2⁺细胞浸润：在 CX3CR1^+/GFP CCR2^+/RFP小鼠中诱导视网膜脱离后，研究人员发现 TS 模型在术后第一天，CD11b⁺ CCR2⁺细胞数量显著高于 TV 模型，表明 TS 模型早期存在更多来源于外周白细胞的 CD11b⁺ CCR2⁺炎症细胞。
3. TV 和 TS 视网膜脱离模型在早期浸润中 Ly6G⁺和 Ly6C⁺细胞的差异：利用流式细胞术对浸润白细胞进行免疫表型分析，发现 TS 模型中 CD45^hi CD11b⁺巨噬细胞 / 小胶质细胞样细胞和 CD45^hi CD11b⁺ Ly6G⁺中性粒细胞的比例显著高于 TV 模型；而 TV 模型中 CD45^hi CD11b⁺ Ly6G^- Ly6C⁺单核细胞的比例更高，说明两种模型在早期视网膜脱离时，Ly6G⁺中性粒细胞和 Ly6C⁺单核细胞的浸润存在差异。
4. TS 视网膜脱离在晚期视网膜脱离中诱导更高的光感受器细胞死亡：使用 Nrl - EGFP⁺小鼠，研究人员分析了视网膜脱离后第七天光感受器的存活情况。结果显示，TS 模型中光感受器数量明显低于 TV 模型，归一化的光感受器存活率也更低，同时 TS 模型中 CD11b⁺细胞的视网膜下浸润更高，表明 TS 模型导致更高的光感受器细胞死亡。
5. TV 和 TS 视网膜脱离模型均诱导显著的反应性胶质细胞增生：研究人员通过检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）荧光强度来量化视网膜胶质细胞增生情况。结果发现，TV 和 TS 模型在脱离的视网膜中均有显著的胶质细胞反应，且在晚期两者的 GFAP 强度相当，说明两种模型在晚期伤口愈合反应上具有可比性。

研究结论与讨论

本研究表明，TS 注射在早期会导致更高的 CD45⁺⁺ CD11b⁺、CD11b⁺ CCR2⁺和 Ly6G⁺白细胞浸润，而 TV 模型在早期与更高的 Ly6C⁺细胞浸润相关；并且 TS 视网膜下注射比 TV 模型导致更高的光感受器细胞死亡。这揭示了两种视网膜下注射方法在免疫反应和光感受器死亡方面存在差异。

TS 模型自 2012 年起成为主要的视网膜下注射方法，可能得益于其技术改进，减少了渗漏和出血，提高了实验的可重复性。然而，TV 和 TS 方法都有各自的局限性。TV 方法在操作过程中会破坏血 - 视网膜屏障（BRB），存在多种出血风险，还可能导致外伤性白内障；TS 方法虽然不进入玻璃体腔，但会局部破坏外 BRB，且角膜穿刺和手术粘合剂的使用也可能带来不良影响。

此前的研究发现，视网膜脱离后光感受器细胞死亡在第一天达到高峰，临床基因治疗注射较大体积液体也会对视网膜产生影响。本研究还指出，不同注射方法引起的炎症反应不同，TS 注射在视网膜和 RPE / 脉络膜中会导致某些细胞因子过表达，而外周单核细胞和中性粒细胞在视网膜脱离中对光感受器细胞死亡有促进作用。

总的来说，这项研究为视网膜下给药提供了重要参考，在设计神经保护或再生策略时，需要考虑两种方法在免疫反应和细胞死亡动力学方面的差异，针对特定的视网膜退行性疾病选择合适的视网膜下注射方法，有望提高治疗效果，为视网膜疾病的治疗开辟新的道路。