肝巨噬细胞来源的外泌体 miR-342-3p 通过抑制星状细胞中的 HPCAL1 促进肝纤维化：潜在治疗新靶点

为探究肝巨噬细胞与肝星状细胞（HSCs）间的外泌体作用机制，复旦大学附属华山医院研究人员开展肝纤维化相关研究。结果发现肝巨噬细胞来源的外泌体 miR-342-3p 可激活 HSCs，HPCAL1 能抑制肝纤维化。该研究为治疗肝纤维化提供新思路。

　　在人体这个复杂的 “小宇宙” 里，肝脏就像一座勤劳的 “化工厂”，默默承担着众多重要任务。然而，当遭遇病毒感染、酒精过度摄入或者能量代谢异常等情况时，肝脏就会拉响 “警报”，启动肝纤维化进程。肝纤维化就像是肝脏的一场 “慢性战争”，如果得不到及时有效的控制，最终可能会发展成肝硬化甚至肝癌，严重威胁人们的健康。但目前临床上针对肝纤维化的靶向药物效果并不理想，这就像在黑暗中摸索，急需一道照亮前路的光。

在这样的背景下，复旦大学附属华山医院的研究人员勇敢地挑起了探索的重担，开展了一项极具意义的研究。他们深入探究肝巨噬细胞与肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells，HSCs）之间的相互作用机制，聚焦于外泌体在其中扮演的角色，以及相关微小 RNA（miRNA）和蛋白的功能。最终，他们发现了肝巨噬细胞来源的外泌体 miR-342-3p 能够激活 HSCs，而 Hippocalcin-like protein 1（HPCAL1）则具有抑制肝纤维化的作用。这一发现为治疗肝纤维化提供了全新的方向和潜在的治疗靶点，就像是在黑暗中找到了开启希望之门的钥匙。该研究成果发表在《Human Genomics》上。

研究人员在探索过程中运用了多种关键技术方法。他们构建了动物模型，通过给 8 周龄雄性 C57BL/6 J 小鼠腹腔注射四氯化碳（CCl₄）诱导肝纤维化，以此模拟疾病发生过程。同时，采用了 Western blotting（蛋白质免疫印迹）技术检测蛋白表达水平，RNA 提取和实时定量 PCR（qPCR）分析基因表达情况，免疫组织化学和免疫荧光染色观察组织和细胞中的蛋白定位及表达，双荧光素酶报告基因实验验证 miRNA 与靶基因的相互作用，还进行了细胞转染、外泌体提取以及免疫沉淀等实验，从不同角度深入剖析相关机制。

研究结果如下：

• 巨噬细胞来源的外泌体介导 HSC 激活增加：研究人员将从 C57BL/6 小鼠肝脏分离的原代肝巨噬细胞和 HSCs 在 Transwell 板中共培养。发现与脂多糖（LPS）处理的巨噬细胞共培养时，HSCs 中 α - 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和 I 型胶原蛋白（collagen I）这两种 HSC 激活的典型标志物转录水平升高。通过电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析，确认巨噬细胞分泌的颗粒是外泌体，且外泌体可被 HSCs 摄取。进一步实验表明，来自 LPS 处理巨噬细胞的外泌体能够激活 HSCs，这充分说明外泌体在巨噬细胞促进 HSC 激活过程中发挥着关键作用。
• 巨噬细胞来源的外泌体 miR-342-3p 通过抑制 HPCAL1 促进 HSC 激活：研究人员利用 CCl₄构建了体内肝纤维化模型，并对正常小鼠和肝纤维化小鼠原代巨噬细胞及 HSCs 进行 miRNA 测序。结果发现，在肝纤维化小鼠模型的原代巨噬细胞外泌体中，miR-342-3p 显著上调。生物信息学分析确定 HPCAL1 是 miR-342-3p 的靶基因，双荧光素酶报告基因实验证实 miR-342-3p 可直接结合 HPCAL1 的 3’非翻译区（3’UTR）。在过表达 miR-342-3p 的原代 HSCs 和 LX2 细胞系中，α-SMA 和 collagen I 的表达增加，而 HPCAL1 的表达降低。同时，与巨噬细胞共培养或加入巨噬细胞来源的外泌体后，HSCs 中 HPCAL1 的表达也会下降。这一系列实验结果清晰地揭示了巨噬细胞来源的外泌体 miR-342-3p 通过下调 HPCAL1 的表达来激活 HSCs。
• HPCAL1 在小鼠和人类的纤维化肝组织中下调并影响 HSC 激活：对肝硬化患者的肝组织进行染色分析发现，肝组织存在严重纤维化、炎症细胞浸润增加、假小叶形成和胶原纤维积累等问题，且 HPCAL1 的表达降低。在 CCl₄处理的小鼠肝组织中，同样观察到 HPCAL1 表达下降。通过对相关数据集的分析以及实时 PCR 检测，均证实了肝硬化组织中 HPCAL1 的 mRNA 水平低于健康组织，且 α-SMA 与 HPCAL1 的 RNA 表达水平呈负相关。在细胞实验中，过表达 HPCAL1 可降低激活的 HSC 标志物表达，而沉默 HPCAL1 则会使这些标志物水平升高。这表明 HPCAL1 在肝纤维化过程中发挥着重要作用，有可能作为肝硬化的生物标志物。
• HPCAL1 在体内减轻肝纤维化：研究人员给 CCl₄处理 8 周和 12 周的小鼠尾静脉注射过表达 HPCAL1 的慢病毒。通过 H&E 染色、Masson 三色染色、免疫组化染色以及 Western blot 分析发现，过表达 HPCAL1 可显著减少肝脏的炎症浸润和胶原沉积，降低 HSC 激活和细胞外胶原沉积水平。这有力地证明了 HPCAL1 过表达基因疗法能够有效逆转肝纤维化。
• HPCAL1 通过调节 Smad2 的泛素化抑制肝星状细胞中的 TGF-β 信号通路：转化生长因子 -β₁（TGF-β₁）在 HSC 激活、纤维化和胶原积累过程中起着至关重要的作用。研究发现，过表达 HPCAL1 可抑制 TGF-β₁处理的 LX2 细胞中 Smad2/Smad3 的表达，并逆转 pSmad2/pSmad3 的增加。进一步研究表明，HPCAL1 与 Smad2 直接相互作用，促进其通过蛋白酶体泛素化降解，且 HPCAL1 的 EF-hand 4 结构域介导了这种相互作用。这揭示了 HPCAL1 抑制肝星状细胞纤维化的分子机制，为治疗肝纤维化提供了潜在的治疗靶点。

综合研究结论和讨论部分，该研究揭示了肝巨噬细胞和 HSCs 之间一种新的促纤维化机制。肝巨噬细胞来源的外泌体 miR-342-3p 通过抑制 HPCAL1 激活 HSCs，而 HPCAL1 可通过调节 Smad2 的泛素化抑制 TGF-β 信号通路，进而抑制肝纤维化。这不仅加深了人们对肝纤维化发病机制的理解，还为治疗肝纤维化等纤维增生性肝脏疾病提供了极具吸引力的新策略。尽管目前研究还存在一些局限性，如 HPCAL1 过表达对肝脏功能的长期影响和潜在副作用尚不明确，其在其他细胞类型中调节细胞外基质积累和纤维化进展的精确分子机制也有待进一步阐明，但靶向 HPCAL1 无疑为未来肝脏疾病的治疗带来了新的希望，有望在临床治疗中发挥重要作用，为众多患者带来福音。