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在肿瘤表观遗传学研究中，存档的福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）存在干扰信号问题。研究人员开展 FFPE 组织经荧光激活细胞分选（FACS）辅助的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）研究。结果显示该方法可精准描述肿瘤细胞表观遗传特征，有助于癌症机制研究与治疗发展。
在生命科学的研究长河中，肿瘤的奥秘始终吸引着众多科研人员不断探索。转录调控元件在癌症发生过程中扮演着关键角色，其中超级增强子（SEs）作为一类特殊的转录增强子簇，能够协同激活癌基因转录，对其深入研究有助于揭示癌症发展机制并指导癌症治疗。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）一直是研究调控元件对 DNA 修饰和调控的重要方法。然而在实际临床研究中，大多只能获取存档的福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE），这种组织由于存在严重的交联，在抗原抗体反应和高质量 DNA 提取方面面临挑战。而且肿瘤组织成分复杂，包含肿瘤细胞以及大量其他正常或反应性细胞，从整个 FFPE 组织获得的组蛋白修饰图谱可能受到非肿瘤细胞成分的干扰，导致对目标肿瘤细胞的表观基因组景观产生错误解读。虽然此前有研究描述了 FFPE 组织的 ChIP 实验方案，但都未涉及如何获取 FFPE 组织中单个纯化细胞群体的组蛋白修饰图谱。在这样的背景下，四川大学华西医院的研究人员开展了一项具有重要意义的研究。
研究人员建立并优化了从血管免疫母细胞性淋巴结 T 滤泡辅助细胞淋巴瘤（nTFHL-AI）患者的 FFPE 淋巴组织中经 FACS 分选纯化细胞后的 ChIP-seq 实验方案，该研究成果发表在《Biological Procedures Online》上。这一研究成果意义重大，它为肿瘤表观遗传学研究提供了更精准的方法，有助于深入了解肿瘤细胞的表观遗传特征，为癌症的机制研究和治疗策略开发提供了有力支持。
在研究方法上，研究人员主要采用了以下关键技术：首先是样本处理，利用 FFPE 组织块，包括扁桃体反应性增生的淋巴组织样本和 nTFHL-AI 患者的样本。接着进行单细胞制备，从 FFPE 组织厚切片经脱石蜡、水化、机械破碎、酶消化和过滤等步骤制备单细胞，之后对细胞进行热处理增强抗原修复和标记，再通过 FACS 分选特定细胞。分选后的细胞进行染色质剪切，随后进行免疫沉淀和 DNA 提取，利用定量 PCR（qPCR）评估 DNA 富集情况，构建 DNA 文库并进行高通量测序，最后对测序数据进行分析。
在研究结果方面：
- 细胞纯化评估：在 nTFHL-AI 淋巴组织中，肿瘤 T 细胞占比少且易被其他淋巴细胞掩盖。研究发现，经 50°C、60min 在 TE 缓冲液中进行抗原修复并过夜抗体标记后，可通过流式细胞术（FCM）成功分离出不同细胞群体，40°C 处理无法标记抗原，65°C 处理则会导致后续实验中组蛋白与 DNA 大量解离。
- 染色质剪切效率：对不同预处理条件下的细胞进行染色质剪切实验，发现经 50°C 处理和蛋白酶 K 消化（条件 III）时，从 300 万个 FFPE 淋巴组织细胞中获得的双链 DNA（dsDNA）量最多，且各处理样本的染色质片段大小大多在 200 - 500bp，相对一致。
- ChIP 的 DNA 回收和靶 DNA 富集效率：通过 qPCR 计算 DNA 回收率和靶基因富集效率，结果表明，50°C 孵育进行抗原修复后再用蛋白酶 K 消化，虽会降低 DNA 回收率，但能显著提高靶 DNA 富集效率，该条件优于其他处理条件。
- FACS 辅助 ChIP-seq 的可重复性：比较新鲜细胞和 FFPE 细胞块的 ChIP-seq 数据中 H3K27ac 信号，发现 FFPE 样本与匹配的新鲜 OCI-LY7 细胞的 H3K27ac 信号高度相关，FFPE 实验重复结果也高度相关，表明该实验方案具有高可重复性。
- 分选细胞中肿瘤类型特异性增强子和 SEs 的鉴定：分析 T、B 细胞特异性表达基因的 H3K27ac 修饰，发现 FACS 有助于去除干扰细胞，且分选后细胞的 SE 信号数量少于未分选组织，通过无监督聚类分析表明，分选后的细胞在组蛋白修饰状态上更接近 Tfh 细胞，能更好地描述目标肿瘤细胞的特征。
研究结论和讨论部分指出，该研究通过 FACS 富集 FFPE 样本中的目标细胞，在靶基因回收、特异性、可重复性以及识别 H3K27ac 和 SEs 图谱方面表现出色。优化的解交联程序适应了 FCM 和免疫沉淀实验。然而，研究也存在一定局限性，如需要设计更精准的疾病和细胞类型特异性标记组合来精确分选细胞，不同肿瘤组织在单细胞制备、解交联和染色质片段制备方面可能有不同要求，需进一步调整实验条件。总体而言，该研究证明了 FACS 辅助 FFPE 样本 ChIP-seq 的可行性，为多种肿瘤类型的研究和治疗开发提供了潜在的应用方向，推动了肿瘤表观遗传学领域的发展，让我们朝着攻克癌症的目标又迈进了一步。
