朊蛋白促进Wilson病中的铜毒性

本研究揭示朊蛋白（PrP）通过促进铜的内吞作用促进Wilson病的铜毒性。作者证明，抑制PrP可减少铜超载和肝损伤，为这种致命的遗传性疾病提供了一种潜在的治疗策略。

　　

探究朊蛋白在威尔逊病铜毒性中的作用：机制与潜在治疗靶点

2025 年 2 月 8 日，来自 Telethon 遗传与医学研究所（TIGEM）等多个单位的研究人员在《Nature Communications》杂志上发表了题为 “Prion protein promotes copper toxicity in Wilson disease” 的论文。该研究首次揭示了朊蛋白（PrP）在威尔逊病（WD）铜代谢失衡中的关键作用，为理解 WD 的发病机制提供了新视角，也为开发针对 WD 的潜在治疗策略奠定了重要基础。

一、研究背景

铜是所有真核生物生长和复制必需的微量元素，在多种重要代谢过程中发挥关键作用。然而，过量的铜会对细胞和生物体造成严重危害，激活特定细胞死亡机制。因此，细胞和生物体进化出了精细调节的转运蛋白和铜结合蛋白网络，以维持铜稳态。

威尔逊病是一种严重的常染色体隐性遗传病，由编码肝脏铜转运蛋白的 ATP7B 基因突变引起。ATP7B 功能丧失导致铜在肝脏和大脑中逐渐积累，引发严重的肝脏和神经异常，最终可导致死亡。目前，批准用于治疗 WD 的方法在许多患者中存在严重缺陷，且由于对可用于恢复铜稳态的分子机制了解不足，新治疗策略的开发受到阻碍。

二、研究材料和方法

（一）细胞模型

使用 ATP7B 基因敲除的 HepG2 细胞（ATP7B-KO HepG2 cells）作为 WD 细胞模型，该细胞不表达 ATP7B 且对铜敏感。同时，培养原代肝细胞，从 6 周龄的 Atp7b 基因敲除小鼠（Atp7b?/?）、Prnp 基因敲除小鼠（Prnp?/?）及两者杂交产生的双敲除小鼠（Atp7b?/?:Prnp?/?）肝脏中分离获取。

（二）实验动物

Atp7b?/?小鼠和 Prnp?/?小鼠分别在 C57BL/6 × 129S6/SvEv 和 C57BL/6 背景下饲养。通过将 Atp7b?/?小鼠与 Prnp?/?小鼠杂交，获得 Atp7b?/?:Prnp?/?小鼠，用于体内实验研究。

（三）实验方法

1. 基因筛选：利用全基因组 shRNA 筛选技术，在 ATP7B-KO HepG2 细胞中筛选能降低铜毒性的基因。使用针对 18,205 个人类基因的慢病毒 shRNA 文库，经细胞转导、处理、基因组 DNA 分离、PCR 扩增、文库制备和下一代测序等步骤，分析筛选结果。

2. 基因沉默与验证：对筛选出的基因，用特异性 siRNAs 进行沉默，并通过 MTT 法、活 / 死染色结合自动高内涵成像等实验，评估沉默基因后细胞对铜的抗性，验证基因功能。

3. 蛋白表达分析：运用 qRT-PCR、Western blot 和免疫组化等方法，检测细胞和动物组织中 PrP 等蛋白的表达水平。

4. 铜含量测定：采用荧光铜传感器 CF4 和电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES），测定细胞和组织中的铜含量。

5. 线粒体功能检测：用线粒体膜电位染料 TMRE 标记细胞，通过共聚焦显微镜观察，评估线粒体功能；借助电子显微镜，观察线粒体的超微结构变化。

6. 动物实验评估：检测小鼠血清中丙氨酸转氨酶（ALT）水平，评估肝脏损伤程度；对肝脏进行组织病理学分析，观察肝脏形态和病理变化；用 ICP-OES 分析肝脏、尿液和粪便中的铜含量。

三、研究结果

（一）筛选促进威尔逊病铜毒性的基因

研究人员在 ATP7B-KO HepG2 细胞中进行全基因组 shRNA 筛选，以寻找可降低铜毒性的基因靶点。筛选后经基因本体（GO）分析发现，与过渡金属运输 / 稳态相关的基因显著富集。进一步用 siRNAs 对这些基因进行二次筛选和验证，确定了多个可降低铜毒性的基因，其中编码朊蛋白的 PRNP 基因和编码转铁蛋白受体 2 的 TFR2 基因表现最为突出。

（二）抑制 PrP 可提高 ATP7B 缺陷细胞对铜的抗性

1. 细胞实验：在 ATP7B-KO 细胞中沉默 PRNP 基因，活 / 死和 MTT 实验表明细胞对铜的抗性显著提高，同时细胞内铜含量减少，铜介导的 MT1X 转录激活降低，线粒体功能改善。

2. 动物实验：在原代肝细胞实验中，Atp7b?/?小鼠与 Prnp?/?小鼠杂交获得的双敲除小鼠原代肝细胞，对铜的敏感性降低。此外，用化学小分子抑制 PrP 表达，也能提高 ATP7B-KO 细胞对铜的耐受性。

（三）ATP7B 缺失导致肝细胞中 PrP 表达升高

研究发现，ATP7B-KO 细胞中铜诱导 PRNP 表达增加，PrP 蛋白水平也高于野生型 HepG2 细胞。在 Atp7b?/?小鼠肝脏中，PrP 表达同样显著升高，WD 患者肝脏组织中 PRNP mRNA 水平也高于健康组织。机制研究表明，铜通过激活金属敏感转录因子 MTF1，促进 PRNP 转录。

（四）PrP 介导的铜毒性需要铜结合位点

研究人员构建了多个 PrP 突变体，包括删除八肽重复区域（PrP-ΔOR）、替换八肽重复区域组氨酸残基（PrP-Ala1）和替换八肽重复及非八肽重复区域组氨酸残基（PrP-Ala2）。实验显示，这些突变体无法像野生型 PrP 那样促进铜介导的细胞死亡，且其内化能力受损，表明 PrP 促进铜毒性需要铜结合位点，且内吞作用对其发挥毒性至关重要。同时，研究发现 PrP 在极化肝细胞的基底外侧定位，利于其从血液中捕获铜并转运到细胞内。

（五）DMT1 和 STEAP1 促进 ATP7B 缺陷细胞中 PrP 介导的铜毒性

全基因组筛选发现，STEAP1 和 DMT1 可能参与将铜从内体转运到细胞质的过程。实验表明，沉默 DMT1 和 STEAP1 可降低 ATP7B-KO 细胞的铜毒性，减少细胞内铜积累，改善线粒体功能。进一步研究发现，STEAP1 和 DMT1 在 PrP 下游发挥作用，共同促进铜毒性。

（六）PrP 抑制改善 Atp7b 基因敲除小鼠的表型

Atp7b?/?小鼠与 Prnp?/?小鼠杂交产生的 Atp7b?/?:Prnp?/?双敲除小鼠，血清 ALT 水平显著降低，肝脏损伤减轻，生存期延长。肝脏组织病理学分析显示，双敲除小鼠肝脏形态更接近正常，纤维化和胆管增生减少。虽然双敲除小鼠肝脏铜含量未显著降低，但电子显微镜观察发现，铜在细胞内的分布发生改变，更多地被捕获在内吞溶酶体中，而非线粒体，且相关铜转运 / 结合蛋白表达变化，促进了铜的螯合和排泄。

四、研究结论

该研究明确了 PrP 在 WD 铜代谢失衡中的关键作用。PrP 通过促进 ATP7B 缺陷肝细胞对铜的摄取，加剧铜毒性。ATP7B 缺失导致细胞内铜积累，激活 MTF1，进而促进 PRNP 表达，形成恶性循环。PrP 介导铜毒性依赖其铜结合位点和内吞作用，DMT1 和 STEAP1 在 PrP 下游协同促进铜向细胞内毒性位点转运。在体内，抑制 PrP 可显著减轻 Atp7b?/?小鼠的肝脏损伤，改善疾病表型。

五、讨论

此前，PrP 在 WD 发病机制和肝脏铜代谢中的作用未得到充分重视，可能是因其在肝脏中表达较低。本研究发现铜可通过 MTF1 激活 PRNP 转录，使 PrP 在 WD 肝脏中表达升高，与其他低亲和力铜转运蛋白一起，协助铜绕过细胞防御机制，导致细胞中毒。

研究还揭示了铜与铁代谢途径在 WD 发病过程中的紧密联系。DMT1、STEAP1 和 STEAP2 等参与铁代谢的蛋白，在 ATP7B 缺陷细胞中也促进铜毒性，表明在特定生理和病理条件下，铜和铁可能共享部分转运蛋白。此外，研究表明铜诱导 ATP7B-KO 细胞死亡的机制不仅包括铜死亡，还涉及其他途径，且 PrP 介导的铜摄取可能通过多种细胞内毒性途径影响细胞，其中部分途径与线粒体损伤相关。

临床研究显示，PRNP 基因多态性可能影响 WD 的发病年龄和症状严重程度。本研究发现 PrP 的 G53S 变异体可增强铜毒性，提示 PRNP 可能是 WD 的重要基因修饰因子。PrP 在铜代谢和相关疾病中的作用复杂，高表达的 PrP 在满足细胞铜需求的同时，也可能促进铜异常积累，与肿瘤发生发展相关。

总体而言，该研究揭示了 PrP 在 WD 中的重要作用，为理解 WD 发病机制提供了新方向，也为开发针对 WD 及其他铜代谢紊乱疾病的治疗策略提供了潜在靶点，未来对 PrP 的深入研究有望为这些疾病的治疗带来新突破。