RNase H1作用的r环影响利什曼原虫DNA复制时间和基因组稳定性

所有的基因组都是按时间顺序复制的，尽管这种时间顺序的决定因素还不清楚。在这里，作者表明，利什曼原虫中不寻常的染色体大小依赖的DNA复制时间受到RNA-DNA杂交的影响，这种杂交被内切酶RNase H1识别。

　　

探秘利什曼原虫基因组：R 环与 RNase H1 对 DNA 复制及基因组稳定性的影响

近日，来自格拉斯哥大学寄生虫学中心（The University of Glasgow Centre for Parasitology）的研究人员 Jeziel D. Damasceno、Emma M. Briggs、Marija Krasilnikova 等在《自然通讯》（Nature Communications）杂志上发表了题为 “R-loops acted on by RNase H1 influence DNA replication timing and genome stability in Leishmania” 的研究论文。该研究揭示了 R 环和 RNase H1 在利什曼原虫（Leishmania）DNA 复制和基因组稳定性中的关键作用，为理解真核寄生虫的基因组调控机制提供了新视角，对开发针对利什曼原虫病的治疗策略具有重要意义。

一、研究背景

真核生物的基因组通常按照特定的时间顺序进行 DNA 复制，这一过程与基因组的稳定性、组成以及进化密切相关。在模式生物（如哺乳动物细胞和酵母）中，对 DNA 复制时间的研究较为深入，发现其与基因组的初级和三级特征存在关联。然而，对于原生动物的基因组复制调控机制，人们了解甚少。利什曼原虫作为一种人类原生动物寄生虫，其 DNA 复制程序具有独特性，染色体复制完成的时间与染色体大小相关，较大的染色体复制完成时间晚于较小的染色体。此前研究表明，利什曼原虫存在广泛的基因拷贝数变异和染色体非整倍性，这种基因组的不稳定性可能与 DNA 复制时间的特殊性有关。此外，R 环作为一种 RNA - DNA 杂交结构，在多种生物过程中发挥作用，但其在利什曼原虫中的分布和功能尚不清楚。基于此，本研究旨在探究利什曼原虫中 R 环的分布规律及其与 DNA 复制时间的关系，以及 RNase H1 在这一过程中的作用机制。

二、研究材料与方法

（一）实验材料

研究使用了来自利什曼原虫主要菌株 LT252（MHOM/IR/1983/IR）的前鞭毛体，在添加 10% 热灭活胎牛血清的 HOMEM 培养基中，于 26°C 培养。通过构建 RNase H1 - HAFlx 细胞系，利用 CRISPR/Cas9 技术将 loxP 位点插入 RNase H1 开放阅读框两侧，并融合 HA 标签，以便后续研究 RNase H1 的功能。

（二）实验方法

1. R 环检测：利用免疫荧光技术，使用 S9.6 抗体检测 R 环在细胞中的亚细胞定位，通过比较未经处理和经重组大肠杆菌 RNase HI 处理的细胞，验证抗体的特异性。采用 DNA - RNA 杂交免疫沉淀测序（DRIP - seq）技术，对利什曼原虫主要基因组中的 R 环进行全基因组定位。
2. RNase H1 研究：运用免疫荧光分析结合 EdU 标记，研究 RNase H1 在细胞中的亚细胞定位及其与 DNA 复制的关系。通过染色质免疫沉淀测序（ChIP - seq），确定 RNase H1 在基因组上的结合位点。
3. DNA 复制时间分析：采用标记频率分析结合 Illumina 测序（MFA - seq）技术，研究 RNase H1 缺失对利什曼原虫染色体 DNA 复制时间的影响。
4. 基因组稳定性检测：通过短读长 Illumina 全基因组测序，分析 RNase H1 缺失后细胞中拷贝数变异（CNV）、单核苷酸多态性（SNP）和小插入缺失（InDel）的变化，评估基因组稳定性。
5. 细胞实验技术：运用流式细胞术检测处于 S 期的细胞；利用显微镜观察细胞形态和相关蛋白的定位；采用 Western blotting 检测蛋白表达水平。

（三）技术路线

研究人员首先对利什曼原虫主要菌株进行培养和基因工程改造，构建用于研究的细胞系。然后，通过免疫荧光和 DRIP - seq 技术检测 R 环的分布，分析其与基因组特征的相关性。利用 ChIP - seq 技术确定 RNase H1 的结合位点，研究其与 R 环的关系。通过 MFA - seq 分析 RNase H1 缺失对 DNA 复制时间的影响，借助全基因组测序评估基因组稳定性的变化。综合各项实验结果，深入探究 R 环和 RNase H1 在利什曼原虫 DNA 复制和基因组稳定性中的作用机制。

三、研究结果

（一）利什曼原虫主要基因组中 R 环的全基因组检测

研究人员通过免疫荧光分析发现，R 环主要定位于利什曼原虫的细胞核中，且 S9.6 抗体信号在经 RNase HI 处理后显著降低，证明了该抗体对 RNA - DNA 杂交体的特异性。DRIP - seq 结果显示，R 环在利什曼原虫主要基因组中广泛分布，在多顺反子转录单元的编码序列（CDS）之间区域积累，与新生转录本丰富、染色质占有率低和 G - 四链体（G4）出现频率高的区域相关。此外，R 环相关的 DNA 序列基序包含多聚嘧啶（和）以及 TA 或 TG 重复序列，且部分 R 环由与反向互补基因组序列对应的 RNA 分子组成，形成于富含嘌呤的序列上。

（二）R 环的全局分布与利什曼原虫染色体大小相关的 DNA 复制时间相关

分析发现，DRIP - seq 密度与利什曼原虫主要染色体长度显著相关，R 环在较大染色体上更为丰富，且在染色体中心区域增加，在亚端粒区域减少。R 环密度与染色体复制时间呈显著负相关，与预测的 DNA 复制起始位点（ORIs）密度也呈负相关。这表明染色体大小相关的复制时间在 R 环和预测的 DNA 复制起始事件的分布中得到体现。

（三）全局 R 环分布与染色体大小相关的染色质可及性、G - 四链体水平和 DNA 序列含量相关

研究人员比较了不同染色体的新生转录本和 mRNA 水平、染色质占有率、G4 水平以及 DNA 序列含量。结果显示，mRNA 水平与染色体长度仅存在适度相关性，新生转录本水平与染色体大小无显著变化。染色质占有率与 DRIP - seq 信号呈显著负相关，表明较大染色体上的 R 环水平较高，染色质相对更松弛。G4 水平与 DRIP - seq 呈显著负相关，在较小染色体上 G4 水平更高。此外，SIDER1 重复序列在较大染色体上富集，与 DRIP - seq 水平显著相关，而 GC 含量与 DRIP - seq 水平呈显著负相关，随着染色体大小增加而降低。

（四）利什曼原虫主要 RNase H1 定位于细胞核并与链切换区域相关

免疫荧光分析表明，RNase H1 主要定位于细胞核，与新生 DNA 的共定位较少，在非复制细胞中更为丰富。ChIP - seq 结果显示，RNase H1 在多顺反子转录单元的边界（链切换区域，SSRs）富集，与乙酰化组蛋白 H3（AcH3）和 β - D - 葡萄糖基 - 羟甲基尿嘧啶（Base J）共定位，且与 R 环峰有相当程度的重叠。进一步分析发现，约 33% 的 R 环区域与 RNase H1 结合，这些区域的染色质可及性较低。此外，RNase H1 在基因组中的积累与 R 环相似，在较大染色体上更为丰富，且这种积累具有细胞周期依赖性，在 S 期至 G2/M 期转换时更为明显。

（五）利什曼原虫主要 RNase H1 缺失导致短暂生长缺陷和 DNA 复制应激下的 R 环积累

通过雷帕霉素介导的 DiCre 激活，条件性敲除 RNase H1 基因。结果显示，敲除后细胞生长明显减慢，持续约 20 天，但随后恢复，表明 RNase H1 缺失在短期内对利什曼原虫前鞭毛体有害，但细胞可适应并恢复繁殖力。在正常生长条件下，RNase H1 缺失未导致 R 环明显积累，但在 G1/S 期用羟基脲处理阻断细胞周期时，R 环显著积累，且该效应具有特异性，仅在 DNA 复制应激时出现。

（六）RNase H1 缺失消除了利什曼原虫染色体大小相关的 DNA 复制时间

MFA - seq 分析表明，RNase H1 缺失后，早期复制的 SSR 周围的 MFA - seq 信号降低，晚期复制的 PTUs 中的信号增加，DNA 复制时间与染色体长度的相关性显著减弱甚至消失。这表明 RNase H1 活性对于维持利什曼原虫的 DNA 复制程序至关重要。

（七）RNase H1 缺失导致基因组不稳定

全基因组测序分析发现，RNase H1 缺失后，细胞中的 CNV 增加，在染色体核心区域更为明显，且在较大染色体上增加幅度更大。KO 细胞中还出现了明显的 DNA 序列丢失，包括亚端粒、核糖体和 SL - RNA 编码位点等区域。此外，RNase H1 缺失还导致了染色体非整倍性的变化，部分染色体的拷贝数发生改变。

（八）RNase H1 缺失导致染色体大小相关的诱变

对诱导和未诱导的 RNase H1Flx 细胞以及 KO 细胞进行 SNP 和 InDel 分析，发现诱导的 RNase H1Flx 细胞在 CDS 间区域的 SNP 积累更为明显，而 KO 细胞中 InDels 积累增加。这些突变在许多 CDS 周围不对称积累，可能与转录和 DNA 复制机制的碰撞方向有关。R 环导致突变水平增加的区域显示出更高的 RNase H1 招募，且与染色质可及性和预测的 DNA 复制起始相关。此外，染色体长度相关的突变积累在 RNase H1 缺失后更为明显。

四、研究结论与讨论

本研究通过 DRIP - seq 和遗传分析，对利什曼原虫主要细胞核基因组中 R 环和 RNase H1 的定位和功能进行了深入研究。结果表明，R 环在利什曼原虫基因组中丰富存在，其分布与染色质可及性、G4 形成和序列组成相关，且与利什曼原虫独特的染色体长度相关的 DNA 复制时间程序密切相关。RNase H1 在维持 DNA 复制时间程序和基因组稳定性方面发挥着关键作用，其缺失会导致 DNA 复制时间的改变、基因组不稳定以及染色体大小相关的诱变。

在局部层面，R 环和 RNase H1 在转录过程中发挥作用，R 环在多顺反子转录单元的 CDS 间区域富集，可能与前体 mRNA 加工有关，而 RNase H1 可作用于转录延伸过程中产生的 R 环。在全局层面，R 环的染色体大小相关分布是利什曼原虫基因组生物学的一个新特征，可能反映了基因组内容和活性在染色体大小上的差异。关于利什曼原虫 DNA 复制时间的调控机制，目前存在两种可能的解释：一是染色体在细胞核中的位置影响复制时间，较大染色体靠近核周，可能导致其复制效率较低；二是 R 环介导 DNA 复制起始，较大染色体需要更多 R 环来支持复制。

本研究揭示了 RNA - DNA 杂交体在利什曼原虫 DNA 复制编程和基因组变异模式中的重要作用，为理解真核寄生虫的基因组调控提供了新的视角。未来研究需要进一步明确利什曼原虫基因组中 DNA 复制起始的具体位置和机制，以及 RNase H1 突变对利什曼原虫适应环境变化能力的影响。这将有助于深入了解利什曼原虫的生物学特性，为开发针对利什曼原虫病的治疗策略提供理论依据。