血管密集的厚三维组织显示间歇性正压构建的蛋白质分泌增强

一种空气压缩间歇压力方法能够制造可移植的厚组织，显示血管化和高蛋白分泌能力，具有潜在的再生医学应用。

　　

间歇性正压助力构建三维组织：血管化与蛋白分泌的新突破

东京女子医科大学先进生物医学工程与科学研究所的 Misako Katsuura、Jun Homma 等研究人员在Communications Biology期刊上发表了题为 “Densely vascularized thick 3D tissue shows enhanced protein secretion constructed with intermittent positive pressure” 的论文。该研究成果为再生医学领域带来了新的思路和方法，在组织工程和细胞治疗方面具有重要的潜在应用价值，有望解决器官移植供体短缺等难题，推动再生医学的发展。

一、研究背景

器官移植是治疗多种难治性疾病的有效手段，但供体短缺严重限制了其广泛应用。再生医学利用组织工程技术构建组织和器官，为解决这一问题带来希望。细胞片技术是组织工程的重要方法，它能维持细胞间连接和黏附因子，有助于构建复杂的三维组织。然而，构建厚组织时，由于组织中心易缺氧和营养不良，简单堆叠细胞片无法实现。此前研究表明，预先构建密集的血管内皮网络可提高细胞片构建组织的效果。在体外构建密集血管内皮网络面临挑战，体内的化学和机械应力在体外难以模拟。目前虽有多种促进体外血管内皮网络形成的方法，如添加促血管生成因子、共培养间充质干细胞（MSCs）和血管内皮细胞（vECs）等，但仍需探索更有效的手段。此外，机械刺激对 vECs 的形态和功能有影响，研究开发了一种体外加压系统，可施加间歇性正压（IPP），但其对细胞的影响尚未完全明确，本研究旨在探究 IPP 对共培养的 MSCs 和 vECs 的作用及 IPP 培养细胞片在移植治疗中的潜力。

二、研究材料和方法

（一）实验材料

实验使用多种细胞，包括人脂肪来源干细胞（hASCs）、表达绿色荧光蛋白的人脐静脉内皮细胞（GFP - HUVECs）、转导了高斯荧光素酶基因和 m - Scarlet - I 基因的 hASCs（GLuc - hASCs）以及源自大鼠胰腺 β 细胞且稳定表达胰岛素 - 高斯荧光素酶融合蛋白的 iGL 细胞。细胞培养使用多种培养基，如 KBM VEC - 1、KBM ADSC - 1、IGLM 等，并添加胎牛血清、青霉素 - 链霉素溶液等。实验还用到温度响应性培养板、各种抗体、试剂以及实验动物（雄性无胸腺大鼠）等。

（二）实验方法

1. 细胞培养与细胞片制备：将 hASCs 和 GFP - HUVECs 按 4:1 比例接种，分别制备不同尺寸的共培养细胞片。细胞接种前，温度响应性培养皿需用胎牛血清包被过夜，培养过程中添加 L - 抗坏血酸磷酸镁盐 n - 水合物（ASA）促进胶原蛋白分泌。培养 24 小时后，将细胞与培养皿转移至 20°C 孵育 30 分钟收获细胞片，之后重新贴附用于后续实验。
2. 加压处理：使用加压生物反应器系统对细胞施加 IPP，将加压单元和压力室置于 5% CO?、37°C 的培养箱中，施加 80 mmHg 的外部压力，加压 120 秒，休息 60 秒，压力在 120 秒内逐渐升至 80 mmHg 并维持 60 秒。
3. 检测与分析方法：运用多种检测手段，如用 Angio Tool v0.5a 软件分析 GFP - HUVECs 的血管内皮网络；用 ImageJ 1.53q 软件等测量细胞片形态和厚度；用 Stat strip Express 900 和 Stat strip Lactate 分别测量葡萄糖和乳酸浓度以计算乳酸 / 葡萄糖（L/G）比；用血细胞计数器计数细胞数量；用胶原定量试剂盒评估细胞片中的胶原蛋白含量；用流式细胞仪分析细胞大小和 GFP - HUVECs 的百分比；用 RNA 测序分析基因表达等。此外，还进行了体内移植实验，将细胞片移植到大鼠的臀浅肌上，评估移植效果。

三、研究技术路线

首先，研究人员将 hASCs 和 GFP - HUVECs 进行共培养，分别设置平面培养和细胞片培养两种环境，并在每种环境下再分为 IPP 处理组（IPP (+)）和未处理组（IPP (-)）。在平面培养环境中，观察 IPP 对细胞形成血管网络、代谢状态和细胞数量的影响；在细胞片培养环境中，探究 IPP 对血管内皮网络形成、细胞片形态和成分变化的作用。通过 RNA 测序分析不同条件下细胞片的基因表达差异，明确 IPP 影响细胞功能的潜在机制。随后，进行体内移植实验，将 IPP (+) 和 IPP (-) 条件下培养的细胞片移植到大鼠体内，评估细胞片的厚度、蛋白分泌功能以及血管灌注情况。同时，设置了缺氧环境和添加 eNOS 抑制剂的实验，进一步探究 IPP 作用的影响因素和机制。

四、研究结果

（一）间歇性正压对平面共培养条件下内皮细胞形成血管网络的影响

在平面环境中，共培养的 hASCs 和 GFP - HUVECs 在 3 天内均形成了血管网络，但 IPP (-) 和 IPP (+) 组的网络连接点数量和总网络长度无显著差异（连接点数量：IPP (-) 组为 7.1 ± 4.1 个 /mm2，IPP (+) 组为 9.4 ± 2.7 个 /mm2，p = 0.10；总网络长度：IPP (-) 组为 3.5 ± 1.2 mm/mm2，IPP (+) 组为 4.2 ± 0.7 mm/mm2，p = 0.09）。这表明在平面共培养条件下，IPP 对血管网络的形成在数量和长度上未产生明显影响。

（二）施加间歇性正压诱导细胞有氧状态和增殖状态

在平面共培养环境中，第 3 天检测发现 IPP (+) 组的 L/G 比低于 IPP (-) 组（IPP (-) 组为 2.0 ± 0.2，IPP (+) 组为 1.8 ± 0.2），且 IPP (+) 组的总细胞数多于 IPP (-) 组（IPP (-) 组为 1190.5 ± 311.7 个 /mm2，IPP (+) 组为 1388.3 ± 257.6 个 /mm2）。这说明施加 IPP 可使细胞处于有氧代谢状态，且促进细胞增殖。

（三）细胞片环境比平面培养环境更有效地建立血管内皮网络

在 hASC 单培养条件下，细胞片环境中血管生成因子（如 VEGFA、ANG 和 HIF1A）的基因表达高于平面环境。在共培养 vECs 时，细胞片环境中血管内皮网络的形成和维持效果均优于平面环境。第 3 天，细胞片环境中的网络连接点数量和总网络长度显著大于平面培养条件（连接点数量：细胞片组为 128.1 ± 29.3 个 /mm2，平面培养组为 12.4 ± 3.2 个 /mm2；总网络长度：细胞片组为 17.2 ± 1.8 mm/mm2，平面培养组为 3.9 ± 0.5 mm/mm2）。到第 5 天，平面培养的血管网络恶化，而细胞片环境中的血管网络仍保持良好。由此可见，细胞片环境更利于血管内皮网络的形成和维持。

（四）间歇性正压下共培养细胞片环境中的血管内皮细胞形成更发达的血管网络

在细胞片环境中，延长评估时间至 5 天，发现 IPP (+) 组的 vECs 形成了更密集的血管内皮网络，其网络连接点数量和总网络长度均显著大于 IPP (-) 组（连接点数量：IPP (-) 组为 62.4 ± 24.7 个 /mm2，IPP (+) 组为 82.7 ± 19.8 个 /mm2；总网络长度：IPP (-) 组为 11.2 ± 2.1 mm/mm2，IPP (+) 组为 13.7 ± 1.8 mm/mm2）。这表明 IPP 能促进细胞片环境中血管内皮网络的形成。

（五）间歇性正压培养导致细胞片形态变化

通过 3D - OCT 系统扫描和分析，发现 IPP (+) 组的细胞片增厚更均匀，其厚度显著大于 IPP (-) 组（OCT 测量：IPP (-) 组为 36.4 ± 4.0 μm，IPP (+) 组为 45.7 ± 8.3 μm；HE 染色测量：IPP (-) 组为 20.0 ± 6.2 μm，IPP (+) 组为 23.3 ± 6.4 μm）。这说明 IPP 有助于共培养细胞片形成更厚的组织结构。

（六）间歇性正压培养的细胞片含有更多胶原蛋白和细胞

天狼星红染色和定量分析显示，IPP (+) 组细胞片中的胶原蛋白含量多于 IPP (-) 组（IPP (-) 组为 9.1 ± 2.0 μg / 片，IPP (+) 组为 11.0 ± 2.3 μg / 片），且细胞数量也更多（第 5 天，IPP (-) 组为 3.6 ± 0.8 × 10?/ 片，IPP (+) 组为 4.3 ± 0.8 × 10?/ 片），细胞活力更高（IPP (-) 组为 69.1 ± 7.3%，IPP (+) 组为 85.0 ± 7.1%），而细胞大小无明显变化。由此可知，IPP (+) 组细胞片增厚是由于胶原蛋白增加和细胞活力提高，而非细胞大小改变。

（七）间歇性正压增加了贴壁细胞片底部的空气饱和度

测量培养基底部与细胞片接触处的空气饱和度发现，IPP (+) 组在达到平衡时的空气饱和度始终高于 IPP (-) 组，且实验可重复性良好。这为 IPP 增加培养基中溶解氧、使细胞在有氧呼吸条件下培养的假设提供了支持。

（八）间歇性正压和非加压条件下共培养细胞片促进血管内皮网络形成相关 RNA 表达的比较

RNA 测序结果表明，IPP (+) 组中与机械转导相关的基因（如 NOTCH1、NOTCH3、NOTCH4、P2RX4 等）、细胞周期相关基因（如 MYC、CCND1、CDK6、CCNA1 等）、细胞外基质相关基因（如 COL1A1、COL4A1、COL4A2 等）以及部分血管生成相关基因（如 PDGFA、PDGFB、PGF 等）表达上调；而与 HIF 家族相关的部分基因（如 HIF1A、ARNT）表达下调，部分血管生成相关基因（如 HGF、FGF7、ANGPT1 等）表达降低。这揭示了 IPP 影响细胞功能和血管内皮网络形成的潜在基因表达机制。

（九）间歇性正压在轻度缺氧条件下不会诱导共培养细胞片增厚

在轻度缺氧环境（12% O?、5% CO?）中培养共培养细胞片，发现 IPP (+) 和 IPP (-) 组的细胞片厚度无显著差异（IPP (-) 组为 33.4 ± 3.5 μm，IPP (+) 组为 33.5 ± 3.3 μm），且与正常条件下 IPP (-) 组的细胞片厚度相比也无明显差异。这表明在轻度缺氧条件下，IPP 对细胞片的增厚作用消失。

（十）eNOS 抑制抑制间歇性正压下共培养细胞片的血管网络形成

添加 eNOS 抑制剂 L - NAME 后，在 IPP (-) 条件下，血管内皮网络形成无明显变化；而在 IPP (+) 条件下，血管网络形成受到抑制，与 IPP (-) 组无 L - NAME 处理时的水平相当。这表明 eNOS 参与了 IPP 诱导的血管网络形成过程。

（十一）评估间歇性正压对体内移植共培养细胞片厚度和功能的影响

将 IPP (-) 和 IPP (+) 组的细胞片移植到大鼠臀浅肌上，结果显示 IPP (+) 组的细胞片厚度显著大于 IPP (-) 组（IPP (-) 组为 21.9 ± 5.6 μm，IPP (+) 组为 27.1 ± 4.2 μm），大鼠血液中 GLuc 荧光强度在 IPP (+) 组有升高趋势（IPP (-) 组为 2600 ± 224 AU，IPP (+) 组为 2824 ± 241 AU，p = 0.13，Cohen's d = 0.96），但两组的血液灌注比无显著差异（IPP (-) 组为 1.2 ± 0.2，IPP (+) 组为 1.4 ± 0.3）。此外，在 iGL、hASCs 和 GFP - HUVECs 的三培养体系中，IPP (+) 组的葡萄糖刺激胰岛素分泌指数显著高于 IPP (-) 组（IPP (-) 组为 1.0 ± 0.2，IPP (+) 组为 1.3 ± 0.2）。这表明 IPP 培养的细胞片移植后能保持厚度，且可能改善某些蛋白分泌功能，同时对内分泌细胞的功能有积极影响。

五、研究结论与讨论

（一）研究结论

本研究表明，IPP 可促进 MSCs 和 vECs 共培养细胞片中 vEC 网络的形成，同时促进细胞的有氧代谢，有利于促血管生成因子的分泌和细胞外基质的合成，使共培养细胞片生长为富含血管内皮网络的厚组织片。IPP 培养的细胞片移植后能成功植入并保持厚度，且可能改善某些蛋白向体循环的分泌。此外，IPP 培养对内分泌细胞（如胰腺胰岛 β 细胞）的功能有积极影响，可提高胰岛素分泌能力。

（二）讨论

此前研究采用多种压力刺激方法促进 vECs 的血管网络形成，本研究的 IPP 方法在共培养环境中也取得了类似效果，但在基因表达方面与其他研究存在差异。本研究中 IPP (+) 组的 VE - cadherin 表达上调，而其他研究中加压刺激对其表达无影响或使其下调，这可能与机械刺激方式不同有关，IPP 诱导的加压主要通过类似剪切应力的机械信号促进血管内皮网络形成，而非静水压力信号。

在细胞片增厚机制方面，虽然机械刺激可使细胞片增厚，但本研究发现，在轻度缺氧环境下，IPP 不能诱导细胞片增厚，且抑制 eNOS 后细胞片仍能增厚，说明 IPP 诱导细胞片增厚主要依赖于溶解氧水平的增加，氧气影响胶原蛋白的聚合，同时 IPP 激活的剪切应力信号促进细胞增殖，细胞数量的差异也对细胞片增厚有贡献。

在体内移植实验中，IPP 培养的细胞片虽形成了更密集的血管内皮网络，但与正常培养组相比，移植后细胞片的血液灌注比无显著差异，可能是因为两组均形成了血管网络，或移植物尺寸较小。然而，IPP 培养的细胞片移植后保持了厚度，且 hASCs 分泌的 GLuc 更高，表明其成功植入且可能增加某些分泌蛋白的血清浓度，但还需进一步研究证实。

综上所述，本研究的 IPP 方法在构建具有密集血管化和高蛋白质分泌能力的功能性、可移植厚组织方面具有潜力，为再生医学中组织工程和细胞治疗提供了新的策略，有望应用于多种内分泌细胞的移植组织制备，以改善内分泌功能。但仍需进一步优化压力条件，明确加压方法与机械信号通路的关系，以充分发挥该方法的优势。