usp4介导的CENPF去泛素化调节结直肠癌的肿瘤转移

　　

探索结直肠癌转移新机制：USP4-CENPF 轴的关键作用

福建医科大学附属协和医院结直肠外科的 Zhongdong Xie 等研究人员在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “USP4-mediated CENPF deubiquitylation regulated tumor metastasis in colorectal cancer” 的论文。该研究揭示了结直肠癌转移过程中关键的分子机制，为结直肠癌的治疗和预后评估提供了新的潜在靶点与生物标志物，在肿瘤研究领域具有重要意义。

一、研究背景

结直肠癌（CRC）是全球范围内常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均较高。尽管当前治疗手段有所进步，但 CRC 复发问题依然严峻，肿瘤转移是导致患者预后不良的主要原因。深入探究 CRC 转移的分子机制，对发现新的生物标志物和治疗靶点至关重要。

基因组不稳定性在肿瘤发生发展中起关键作用，其中染色体不稳定性（CIN）常见于癌前病变和恶性肿瘤。着丝粒及其相关的动粒在细胞有丝分裂中对纺锤体附着、染色体排列、有丝分裂检查点激活和姐妹染色单体分离至关重要，其异常表达可引发 CIN。着丝粒蛋白 F（CENPF）作为着丝粒蛋白家族的重要成员，参与多种细胞活动，在多种恶性肿瘤进展中发挥作用，但在 CRC 中的生物学作用和预后价值尚不明确。

泛素化作为重要的蛋白质翻译后修饰方式，参与调控众多细胞过程。同时，去泛素化酶（DUBs）可去除蛋白质上的泛素分子，对蛋白质的稳定性、活性和定位产生影响。已有研究表明部分着丝粒蛋白家族成员受泛素 - 蛋白酶体途径调控，因此探究调控 CENPF 的 DUBs 及其在 CRC 治疗中的潜在作用具有重要意义。

二、研究材料与方法

（一）伦理声明

研究获得各参与中心机构审查委员会的伦理批准，动物实验遵循相关机构的动物实验伦理标准，并经福建医科大学伦理委员会批准。

（二）研究患者

研究共纳入 519 例经组织学确诊的典型结直肠腺癌患者。其中，温州医科大学附属第一医院 2014 年 4 月至 2016 年 12 月接受根治性手术的 393 例患者标本构成队列 I，作为训练数据集；福建医科大学附属协和医院 2010 年 1 月至 2011 年 12 月接受根治性手术的 126 例患者标本构成队列 II，用于外部验证。

（三）随访与生存分析

患者术后前 2 年每 3 个月进行一次随访检查，后 3 年每 6 个月检查一次。利用 X-tile 软件确定上皮 CENPF 免疫组化（IHC）评分的最佳临界值，应用于评估 CENPF 蛋白表达与总生存期（OS）、无病生存期（DFS）的关系，同时确定 USP4 的最佳临界值并进行生存分析。

（四）免疫组化

使用兔多克隆抗体对 USP4、CENPF、Beclin-1、LC3B、ATG7 进行免疫组化染色，依据染色强度和阳性细胞百分比计算 IHC 评分，由两位经验丰富的病理学家在盲法条件下评估目标蛋白评分，通过 Cohen’s Kappa 指数评估评分系统可靠性。

（五）基因组数据挖掘

从 Gene Expression Omnibus（GEO）和 TCGA 数据库获取相关数据集，提取自噬基因表达谱和蛋白质编码基因，运用 R 语言环境中的多个软件包进行数据分析，探究基因间相关性、差异表达基因以及 CENPF mRNA 表达与 DFS 的关系。

（六）细胞模型

选用 HCT116、SW480、DLD1 等人结直肠癌细胞系和 HEK293T 人胚肾上皮细胞系，通过 STR 分型进行细胞系鉴定，在特定培养基和培养条件下培养，确保细胞无支原体污染。

（七）免疫沉淀和泛素化实验

使用自制裂解缓冲液裂解细胞，对细胞内源性和外源性过表达蛋白质分别进行免疫沉淀实验，次日进行蛋白质免疫印迹（Western blot）分析，检测蛋白质泛素化水平。

（八）Transwell 迁移实验

将细胞接种于 Transwell 小室，置于含血清培养基的下室中培养 24 小时，固定并染色迁移到下表面的细胞，随机选取视野拍照计数，评估肿瘤细胞迁移能力。

（九）裸鼠肿瘤生长和肝转移实验

选取 5 周龄雌性无胸腺裸鼠，适应环境后分组，分别皮下注射转染不同质粒的癌细胞，定期测量肿瘤体积。通过脾内注射癌细胞评估肝转移能力，8 周后处死小鼠评估肝转移情况。

（十）CCK-8 实验和集落形成实验

分别使用 CCK-8 试剂盒和集落形成实验检测细胞活力和增殖能力。

（十一）Western blot 分析

采用特定的蛋白质 Marker 和凝胶试剂盒对高分子量蛋白质进行 Western blot 分析，按照标准流程进行电泳、转膜等操作，使用相应抗体检测目标蛋白表达。

（十二）免疫荧光（IF）

对细胞进行固定、封闭处理后，与 CENPF 和 USP4 的一抗孵育过夜，再与二抗孵育，用 DAPI 染色细胞核，通过荧光显微镜观察。

（十三）统计分析

运用 R 和 SPSS 软件进行统计分析，设定 P<0.05 为差异具有统计学意义，根据数据分布情况选择合适的统计方法进行分析。

三、研究技术路线

首先，研究人员通过分析多个生物信息数据库，结合免疫组化等实验，筛选出与 CRC 转移相关的潜在基因 CENPF。接着，构建体外和体内细胞模型，分别从细胞和动物水平研究 CENPF 对 CRC 细胞迁移、侵袭和转移能力的影响。随后，通过生物信息学预测、免疫沉淀、Western blot 等实验，探究 CENPF 蛋白的调控机制，发现其与 USP4 的相互作用关系。最后，分析临床样本中 USP4 和 CENPF 的表达情况及其与患者预后的关联，明确 USP4-CENPF 轴在 CRC 中的作用。

四、研究结果

（一）自噬相关 CENPF 被确定为 CRC 转移的关键参与者

研究人员分析了结直肠癌组织中关键自噬调节因子的表达模式和临床相关性，发现 Beclin-1、LC3B 和 ATG7 蛋白在肿瘤组织中的表达高于正常组织，且在复发患者中进一步升高，高表达这些自噬蛋白与患者较短的无病生存期相关，表明自噬激活可能促进 CRC 转移。

通过对多个基因数据集的分析和筛选，结合细胞迁移实验，发现敲低 CENPF 对 HCT116 细胞迁移抑制作用最为显著。进一步研究表明，CENPF mRNA 和蛋白在结直肠癌组织中表达上调，且与肿瘤复发相关。多队列生存分析显示，高 CENPF 蛋白表达与较差的 DFS 和 OS 相关，是 CRC 患者预后的独立预测因子，提示 CENPF 在 CRC 转移中起促进作用。

（二）敲低 CENPF 抑制结直肠癌细胞的体外和体内迁移、侵袭

在 DLD-1、HCT116 和 SW480 细胞中稳定敲低 CENPF，Transwell 迁移和侵袭实验、划痕愈合实验结果表明，敲低 CENPF 显著削弱了细胞的迁移和侵袭能力，且过表达 CENPF 可逆转这一现象。CCK-8 实验和集落形成实验显示，敲低 CENPF 对 CRC 细胞体外生长无显著影响。

在体内实验中，将敲低 CENPF 的 CRC 细胞注射到裸鼠脾脏后，SW480 和 DLD1 细胞形成肝微转移的能力明显受损，组织学检查也证实了这一点，同时敲低 CENPF 延长了小鼠生存期，但对肿瘤大小无显著影响，进一步证明 CENPF 在 CRC 转移中起促进作用。

（三）USP4 与 CENPF 相互作用并被确定为 CENPF 的候选去泛素化酶

研究发现 CENPF 蛋白可发生泛素化修饰，其蛋白水平随蛋白酶体抑制剂 MG132 处理剂量增加而升高。通过筛选 53 种人类 DUBs 表达文库，发现 USP4 能与 CENPF 相互作用。免疫共沉淀实验证实了外源性和内源性的 USP4 与 CENPF 之间的相互作用，免疫荧光染色显示两者在细胞核中共定位，且 USP4 的 USP 结构域介导了与 CENPF 的结合，表明 USP4 是调节 CENPF 稳定性的最有潜力的去泛素化酶。

（四）USP4 去泛素化并稳定 CENPF

过表达 USP4 可稳定内源性和外源性表达的 CENPF，敲低 USP4 则降低 CENPF 蛋白表达，但两者均不影响 CENPF mRNA 水平，说明 USP4 在转录后水平稳定 CENPF 蛋白。

构建 USP4 催化活性缺失的突变体 C311S，实验表明野生型 USP4 可降低 CENPF 的泛素化水平、稳定 CENPF 蛋白、延长其半衰期，而突变体则无此作用。临床样本分析显示，USP4 和 CENPF 蛋白表达呈正相关，但 mRNA 水平无此相关性，且高表达 USP4 与 CRC 患者不良预后相关，证明 USP4 是 CENPF 的强效去泛素化酶，有助于上调 CENPF 蛋白表达。

（五）CENPF 受 USP4 正调控并影响 CRC 细胞的转移能力

在 HCT116 和 DLD1 细胞中敲低 CENPF 并过表达 USP4，Transwell 实验和伤口愈合实验显示，过表达 USP4 可显著增强敲低 CENPF 条件下 CRC 细胞的迁移能力。动物实验表明，上调 USP4 表达可增强敲低 CENPF 的 CRC 细胞形成肝微转移的能力，证明 CENPF 受 USP4 正调控，且两者相互作用影响 CRC 细胞的体外和体内转移能力。

（六）USP4-CENPF 轴与 CRC 患者的临床结局相关

根据 USP4 和 CENPF 蛋白水平将队列 I 样本分为四组进行生存分析，结果显示高 USP4 和高 CENPF 表达的患者 DFS 和 OS 最差，表明 USP4-CENPF 轴在 CRC 发展中起重要作用。

五、研究结论

本研究首次揭示 CENPF 是结直肠癌转移的新型促进基因，USP4 通过与 CENPF 相互作用并使其去泛素化，稳定 CENPF 蛋白，进而调控结直肠癌细胞的迁移、侵袭和转移能力。USP4-CENPF 轴与结直肠癌患者的预后密切相关，高表达 USP4 和 CENPF 的患者预后较差。该研究为结直肠癌转移机制提供了新的见解，USP4-CENPF 轴有望成为结直肠癌治疗的潜在靶点和预后评估的生物标志物，为开发新的治疗策略奠定了理论基础。

六、讨论

肿瘤复发是影响结直肠癌患者预后的重要因素，本研究利用生物信息学分析筛选出关键基因 CENPF，深入研究其在 CRC 转移中的功能和调控机制，发现了新的 USP4-CENPF 轴，为 CRC 治疗提供了潜在方向。然而，研究也存在一定局限性。一方面，虽然明确了 CENPF 转录后修饰的调控机制，但对其转录水平异常升高的机制尚未深入探究；另一方面，USP4-CENPF 轴在 CRC 转移中的具体下游分子机制尚不明确，自噬激活通过 CENPF 介导 CRC 转移的机制也有待进一步研究。

尽管如此，该研究成果仍具有重要意义。它揭示了结直肠癌转移过程中关键的分子事件，为后续深入研究结直肠癌的发病机制提供了新的思路，也为开发更有效的靶向治疗药物和精准预后评估方法提供了理论依据，有望推动结直肠癌治疗领域的发展，改善患者的预后。