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本文全面综述了 CRISPR–Cas13 系统在核酸治疗中的应用。该系统作为 RNA 编辑工具，能实现 RNA 敲低、碱基编辑、剪接调控等。不过，其应用面临特异性、脱靶效应和递送等挑战。文章还探讨了 AI 助力下的优化方向，对推动核酸治疗发展意义重大。
引言
核酸治疗领域中，CRISPR 技术是创新疾病治疗方法的先锋。CRISPR–Cas9 介导的 DNA 编辑可修复基因突变，为疾病治疗提供了有力策略。而 CRISPR–Cas13 系统作为 RNA 编辑的有效工具，在核酸治疗领域取得了显著进展。
CRISPR–Cas13 系统属于 2 类 VI 型系统，由单个效应蛋白 Cas13 与 CRISPR RNA（crRNA）复合而成，无需 tracrRNA。Cas13 蛋白含有核苷酸结合结构域，具备加工前体 crRNA、切割靶 RNA 和降解非特异性旁系 RNA 的能力。该系统在 crRNA 引导下，无需原间隔序列相邻基序（PAM）就能靶向 RNA 序列，靶标范围更广，且在 RNA 操作方面效率高、特异性强，为转录组工程提供了有效手段，拓宽了 RNA 编辑的视野，推动了 RNA 治疗学的发展。在核酸治疗中，编辑工具的效率、特异性和递送机制一直是研究重点。
RNA 敲低
多种 Cas13 效应蛋白已被发现，如 Cas13a、Cas13b 等。与 Cas9 相比，Cas13 在哺乳动物细胞中对 RNA 敲低的靶向能力更广泛。Cas9 靶向 DNA 需要 PAM，而 Cas13 效应蛋白通常偏好特定的原间隔序列侧翼序列（PFS），不过 RfxCas13d 无需 PFS 就能靶向和切割 RNA，这一特性使其在哺乳动物系统的 RNA 编辑中更具通用性和实用性。
RfxCas13d 在体外和体内实验中都能高效靶向细胞 RNA，特异性高、敲低率高，且分子尺寸小、编辑效率高，适合通过腺相关病毒（AAV）载体递送。它已被用于多种治疗应用，如靶向 PCSK9 基因改善胆固醇代谢相关疾病；靶向 Tmc1 基因预防常染色体显性遗传性听力损失；靶向 VEGFA 基因减缓年龄相关性黄斑变性进展；在抗击病毒疾病方面也有潜力，还能增强嵌合抗原受体 T 细胞（CAR - T）的适应性和抗肿瘤活性，提升 CAR - T 细胞疗法的疗效。
RNA 碱基编辑
超过一半的人类遗传疾病由单核苷酸突变引起，RNA 碱基编辑对于逆转这些点突变意义重大。基于 Cas13 的 RNA 碱基编辑器利用催化失活的 CRISPR–Cas13（dCas13）作为 RNA 靶向系统，结合外源脱氨酶发挥作用。当 crRNA 的间隔区与靶序列存在单个错配时，脱氨酶可捕获并催化靶 RNA 上翻转出来的核苷酸，实现靶位点的碱基改变。
REPAIR（RNA 编辑用于可编程 A 到 I 替换）和 RESCUE（RNA 编辑用于特异性 C 到 U 交换）系统是该领域的重要进展，它们分别通过将失活的 Cas13b 与人类作用于 RNA2 的腺苷脱氨酶（hADAR2）融合，实现 A 到 G 和 C 到 U 的碱基转换。此外，CURE 利用与 dCas13b 融合的 hAPOBEC3A 进行精确的 C 到 U 编辑。为提高 RNA 碱基编辑器的精度，REPAIRv2、REPAIRx 等工具不断涌现，旨在减少脱靶效应。同时，为适应 AAV 载体的大小限制，利用较小的 Cas13 蛋白开发了紧凑型 RNA 碱基编辑器。这些编辑器已成功用于纠正致病性点突变，如 mxABE 可纠正杜氏肌营养不良相关的无义突变，emxABE 可改善隐性听力损失相关的 Otoferlin 基因错义突变。
RNA 剪接
前体信使 RNA（mRNA）的可变剪接是基因表达的重要机制，异常剪接会引发多种人类疾病。失活形式的 Cas13 为靶向纠正异常剪接事件提供了多样平台。dCas13 可通过工程改造与剪接元件相互作用，阻碍剪接机制，诱导外显子跳跃；还能通过与剪接因子结构域融合，增强干预的精度和效果，实现外显子包含。CRISPR 人工剪接因子（CASFx）通过用 dCasRx 替换剪接因子的 RNA 识别基序，促进外显子包含。诱导系统如 iCASFx 利用雷帕霉素诱导的 FKBP - FRB 二聚化系统，实现对可变剪接的动态控制。进一步发展的 CASFx - SR 平台，将剪接调节因子中富含丝氨酸 / 精氨酸（S/R-rich）的结构域与 dCas13 技术结合，有助于研究剪接因子在肿瘤生物学中的作用。
传统的顺式剪接受限，促使了反式剪接平台的发展。CRISPR 辅助的 mRNA 片段反式剪接（CRAFT）系统利用 Cas13 系统将外源 RNA 反式剪接到内源性前体 mRNA 中，重组 CRAFT RNA 整合了 crRNA、剪接元件和外源 RNA 片段，在 dCas13 的作用下实现靶向的外显子修饰。为增强外源 RNA 片段的招募，可引入 MCP - MS2 发夹模块。RESPLICE 则采用两种不同的 Cas13 效应蛋白，一种抑制顺式剪接，另一种引导反式剪接货物，提高了整体效率。Cas13 介导的反式剪接可实现多种遗传改变，包括颠换、转换、插入和缺失。
RNA 表观遗传修饰
RNA 修饰在基因表达调控中至关重要，影响众多生物学过程和疾病进展。哺乳动物 mRNA 上的 N6- 甲基腺苷（m6A）修饰广泛存在。利用 dCas13 系统的特异性结合不同的表观遗传酶，可实现对这些修饰的靶向调控。将 dCas13 与甲基转移酶或去甲基酶融合，能在细胞核或细胞质的特定位点选择性引入或去除 m6A，减少脱靶效应。结合 m6A 阅读器蛋白（如 YTHDF）与 dCas13，有助于深入研究特定 RNA 分子的生物学功能。通过将 FKBP 失稳结构域与 dCas13b - ALKBH5（一种去甲基酶）结合，利用小分子 Shield - 1 实现对 m6A 去除的动态控制。此外，将 dCas13b 与甲基转移酶 METTL3 融合，对靶肿瘤抑制因子 mRNA 引入 m6A 修饰，提高其稳定性，为抗癌治疗提供了新途径。
在 RNA 表观遗传学领域，将失活的 Cas13（dCasRx）与 m1A 去甲基酶融合开发的改良 m1A 橡皮擦，可选择性去除特定 RNA 转录本上的 m1A 修饰，探索 m1A 修饰与表型之间的关系。重新配置的 m5C 修饰系统，通过将 dCasRx 与甲基转移酶或去甲基酶融合，实现对 RNA 上 m5C 修饰的精准控制。
翻译调控
翻译调控对基因表达控制至关重要，dCas13 为精确调控这一过程提供了独特机会。CRISPR/dCasRx - SINEB2 平台将 dCasRx 的 crRNA 与 SINEB2 基序结合，SINEB2 基序能促进核糖体招募，提高基因表达，实现对特定基因的靶向高效翻译激活，且脱靶效应低。
另一方面，dCas13 可单独或与翻译抑制因子结合抑制翻译，且不导致 mRNA 降解，这在研究基因功能和调控基因表达策略开发中具有重要价值。CRISPRδ 平台就是 dCas13 用于翻译抑制的实例，dCas13b 凭借强大的 mRNA 结合能力，特异性阻碍人类细胞的翻译起始，当它靶向 mRNA 的起始密码子或 5’非翻译区时，可阻止核糖体进入或扫描，从而抑制翻译。
RNA 编辑的智能设计
人工智能（AI）与生物学的融合推动了 RNA 编辑的发展。Cas13 介导的 RNA 编辑的靶向效率和脱靶效应受多种因素影响，包括 Cas13 蛋白的内在特性、引导 RNA 序列、RNA 二级结构、靶标可及性和上下文依赖性等，这些因素相互关联，机制复杂且尚未完全明晰。
AI 算法的出现和筛选数据集的扩充为阐释和预测 RNA 编辑结果提供了有力工具。例如，靶向抑制基因表达的引导 RNA 设计（TIGER）模型，基于引导序列和上下文信息预测 Cas13d 在 RNA 敲低中的靶向和脱靶活性；DeepCas13 深度学习模型通过分析 sgRNA 序列和 RNA 二级结构特征预测靶向效率，借助该模型成功开发出编辑效率更高的较小 Cas13 变体。AI 技术的应用使对 Cas13 效率和特异性的预测更加准确，加速了 RNA 编辑工具在治疗领域的应用。
展望
CRISPR–Cas13 系统开启了 RNA 编辑的新时代，在 RNA 病毒诊断、RNA 成像、RNA 碱基编辑、RNA 表观基因组编辑和治疗干预等方面展现出广阔的应用前景。它尤其适用于对 RNA 进行临时改变或 DNA 编辑困难的场景。随着研究向临床应用推进，优化 RNA 编辑器成为关键，主要集中在提高编辑效率、降低 RNA 脱靶效应和优化包装系统尺寸以利于递送等方面。AI 技术通过预测编辑效率和脱靶效应，显著提升了 RNA 编辑器的精度和效率，对减少治疗应用中的意外基因修饰至关重要，未来 AI 有望进一步助力个性化 RNA 编辑治疗。
然而，CRISPR–Cas13 系统的治疗应用仍面临诸多挑战。Cas13 的旁系切割活性可能带来未知风险和影响，需要深入研究其核酸酶机制并进行工程改造。部分基于 Cas13 的工具尺寸较大，给单 AAV 载体系统的开发带来困难，因此开发更紧凑的 Cas 蛋白或探索招募内源性效应物等替代策略迫在眉睫。临床治疗对疗效和安全性要求极高，提高 RNA 编辑器的效率和特异性至关重要。此外，Cas13 蛋白在体内长期组成性表达可能引发免疫毒性和脱靶效应担忧。越来越多的可控操作方法，如基于光遗传学和材料学的方法，正被应用于 Cas13，有望实现 Cas13 编辑工具的可控表达和活性调节，推动 RNA 编辑的临床应用。
